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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何降低，多克隆抗体非特异性？
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未知树

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】如何降低，多克隆抗体非特异性？ 已有7人参与

制备了一种多抗，但是，在进行细胞内免疫荧光实验时，非特异性非常非常的强，几乎与实验组无法区分。

制备过程：
1，克隆目的基因至表达载体pMal-C4x。
2，表达纯化目的蛋白。X-MBP（带有MBP标签的融合蛋白）
3，纯化融合蛋白X-MBP，很纯！
4，注射新西兰大白兔。
5，收集血清。


PS： 注射大白兔之前，没有切除标签蛋白MBP（约42KDa）.
在western blot试验中， 该抗体的特异性非常好。 但是， 当用于细胞实验室时， 非特异性出奇的高， 实验组和对照组， 一模一样， 几乎看不出任何区别。

在网上查看看了一些方法， 仍然不是太明白。

如何才能有效地降低特异性。  
请各位虫友支招，万分感谢~
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1楼 2011-02-14 22:40:50
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+5): good 2011-02-15 09:29:29
可能原因：
1.多抗是否纯化？去除非特异性的其他蛋白？WB和荧光对抗体的要求是不同的。
2.细胞中是否有其他蛋白与其有交叉反应？
3.阴性对照结果如何，即用同源的抗体进行试验？
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52187644
2楼2011-02-15 09:03:12
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
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dhd997(金币+5): good 2011-02-15 14:11:36
1、用你纯化的重组蛋白偶联制作亲和层析介质，然后进行亲和纯化。
2、设计多肽免疫。
3、非融合表达目的蛋白。

但不管怎样免疫，用免疫原偶联进行亲和纯化都是需要的。用抗血清效果肯定要差些。
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hyanzi9920
生物资源交流QQ群：1044518333
3楼2011-02-15 09:30:23
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
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dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-02-15 14:11:52
免疫荧光对抗体要求很高，都是用单克隆抗体做的吧
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4楼2011-02-15 14:05:21
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未知树

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by snoopyzxx at 2011-02-15 09:30:23:
1、用你纯化的重组蛋白偶联制作亲和层析介质，然后进行亲和纯化。
2、设计多肽免疫。
3、非融合表达目的蛋白。

但不管怎样免疫，用免疫原偶联进行亲和纯化都是需要的。用抗血清效果肯定要差些。

没有啊， 我们实验室的另外一种抗体，就是多抗啊， 是用纯化的病毒粒子，直接注射大白兔得到的。 用的也非常的好啊
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每一天都是一个新的起点
5楼2011-02-15 17:14:05
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未知树

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2011-02-15 09:03:12:
可能原因：
1.多抗是否纯化？去除非特异性的其他蛋白？WB和荧光对抗体的要求是不同的。
2.细胞中是否有其他蛋白与其有交叉反应？
3.阴性对照结果如何，即用同源的抗体进行试验？

1，抗体没有纯化，直接取的兔血清。
2，细胞中如果有其他蛋白与其有交叉反应的话， 我们是不是可以将细胞破碎，与抗体共孵育，然后离心，得到的抗体就是消除非特异性的抗体了？
3，目前， 阴性对照，只是用的没有感染病毒细胞做的，抗体和实验组是一样的。   结果也是跟实验组一样，红成一片
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6楼2011-02-15 17:17:43
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
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dhd997(金币+2): 热心 2011-02-16 10:39:14
引用回帖:
Originally posted by 未知树 at 2011-02-15 17:17:43:


1，抗体没有纯化，直接取的兔血清。
2，细胞中如果有其他蛋白与其有交叉反应的话， 我们是不是可以将细胞破碎，与抗体共孵育，然后离心，得到的抗体就是消除非特异性的抗体了？
3，目前， 阴性对照，只是用 ...

根据你的情况，我还是建议你将血清纯化之后再做，不管怎么说没有感染病毒的细胞又有反应，这说明血清中的其他成分和细胞中中的某些抗原结合了。一般来说对照里面会有一个同型血清的对照，你试试看吧。
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52187644
7楼2011-02-16 08:51:24
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阿娇阿娇

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楼主你好，我最近也要做多抗，是MBP-NAP融合蛋白，想来制备NAP的多抗。

你当初用X-MBP（带有MBP标签的融合蛋白）去免疫，是为了得到X的多抗吗？是把X偶联制作亲和层析介质，进行亲和纯化的吗？谢谢解答
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8楼2012-03-22 14:12:26
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未知树

木虫 (著名写手)
引用回帖:
1603498楼: Originally posted by 阿娇阿娇 at 2012-03-22 14:12:26:
楼主你好，我最近也要做多抗，是MBP-NAP融合蛋白，想来制备NAP的多抗。

你当初用X-MBP（带有MBP标签的融合蛋白）去免疫，是为了得到X的多抗吗？是把X偶联制作亲和层析介质，进行亲和纯化的吗？谢谢解答

我们用的是invotrigen公司的MBP纯化系统， 所有步骤都是按照上面来的。
是制备多抗。
你看看他们公司的操作手册吧，上面还挺清楚的。
如果靶标蛋白太小， 必须要切除MBP的。 不然会影响抗体的效果。
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9楼2012-03-22 19:41:03
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阿娇阿娇

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
1603533楼: Originally posted by 未知树 at 2012-03-22 19:41:03:
我们用的是invotrigen公司的MBP纯化系统， 所有步骤都是按照上面来的。
是制备多抗。
你看看他们公司的操作手册吧，上面还挺清楚的。
如果靶标蛋白太小， 必须要切除MBP的。 不然会影响抗体的效果。

invotrigen公司的MBP纯化系统？我怎么找不到啊，是用来纯化MBP-X融合蛋白的吗？楼主的X是多大的蛋白，你直接用 MBP-X 去免疫的吗？
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10楼2012-03-23 11:38:43
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