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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】为什么测序和读码框都正确的酵母蛋白在大肠中不表达
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xucan0901

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】为什么测序和读码框都正确的酵母蛋白在大肠中不表达

我的这个基因是酵母中的但是没有内含子，蛋白较大155kDa，
转入表达两种表达质粒了，有一种还侧过序l了。
     我做过好多条件了，温度从10°到37°，iptg从0.4到1.2mM ,时间从3h到20h都做过了，iptg诱导后跑全细胞电泳感觉根本没有表达。
    后来听说要加甘油试试，我感觉不靠谱，因为加甘油是为了增加目的蛋白的溶解性的，我的全细胞都没有，就根本没有必要考虑溶解性了。
    后来又听说稀有密码子问题，叫我换Rosetta（DE3）菌株，这个我还没来得及做过不知道值 不值得一试。

希望高手指教指教，真的搞奔溃了，同学做实验搞两下就出来了，我的怎么处处都是坎呐！拜谢了。
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1楼 2011-01-18 22:42:54
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susizheng

木虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 有可能吧 2011-01-19 09:39:51
xucan0901(金币+1): 2011-01-19 10:12:34
是不是蛋白太大了，先问问有没有表达过这么大的蛋白的先例。
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2楼2011-01-18 22:49:23
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-01-19 09:40:02
xucan0901(金币+1): 2011-01-19 10:12:40
主要是两个问题，密码子偏爱性和蛋白分子量太大。
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3楼2011-01-18 22:57:56
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-01-19 09:40:13
xucan0901(金币+1): 2011-01-19 10:12:46
xucan0901(金币+2): 谢谢你，我也想用Rosetta（DE3）试试。 2011-01-19 10:17:30
稀有密码子多的话 Rosetta（DE3）菌株 可以试试，我的是66kda的用普通的BL21做不出来，Rosetta（DE3）一次就成功了。值得一试
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4楼2011-01-19 09:23:32
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xucan0901

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-01-18 22:49:23:
是不是蛋白太大了，先问问有没有表达过这么大的蛋白的先例。

我问过其他的博士师兄，他说他们实验室表达过比这大的多的蛋白。
应该不是蛋白太大的原因。
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5楼2011-01-19 10:20:41
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chenxiang29

银虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
4楼: Originally posted by 小虫子666 at 2011-01-19 09:23:32
稀有密码子多的话 Rosetta（DE3）菌株 可以试试，我的是66kda的用普通的BL21做不出来，Rosetta（DE3）一次就成功了。值得一试

请问稀有密码子多，是什么程度呢，比如450bp基因中有5个稀有密码子算不
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6楼2013-04-30 19:10:32
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chenxiang29

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换了rostta不？怎么样了
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7楼2013-04-30 19:12:55
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wanglei512

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
细菌来源的基因，BL21比较好；真菌来源的，transette比较好。
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8楼2013-04-30 19:22:46
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wanglei512

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们实验室直接放在脱色摇床上摇，因为氧气量比较足，这两天实验室温度也差不多在20度左右，效果还不错。可溶性蛋白比较多，以前基本在沉淀里面
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9楼2013-04-30 19:26:41
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