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xucan0901

铜虫 (初入文坛)


[交流] 【求助/交流】为什么测序和读码框都正确的酵母蛋白在大肠中不表达

我的这个基因是酵母中的但是没有内含子,蛋白较大155kDa,
转入表达两种表达质粒了,有一种还侧过序l了。
     我做过好多条件了,温度从10°到37°,iptg从0.4到1.2mM ,时间从3h到20h都做过了,iptg诱导后跑全细胞电泳感觉根本没有表达。
    后来听说要加甘油试试,我感觉不靠谱,因为加甘油是为了增加目的蛋白的溶解性的,我的全细胞都没有,就根本没有必要考虑溶解性了。
    后来又听说稀有密码子问题,叫我换Rosetta(DE3)菌株,这个我还没来得及做过不知道值 不值得一试。

希望高手指教指教,真的搞奔溃了,同学做实验搞两下就出来了,我的怎么处处都是坎呐!拜谢了。
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xucan0901

铜虫 (初入文坛)


引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-01-18 22:49:23:
是不是蛋白太大了,先问问有没有表达过这么大的蛋白的先例。

我问过其他的博士师兄,他说他们实验室表达过比这大的多的蛋白。
应该不是蛋白太大的原因。
5楼2011-01-19 10:20:41
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★ ★
dhd997(金币+2): 有可能吧 2011-01-19 09:39:51
xucan0901(金币+1): 2011-01-19 10:12:34
是不是蛋白太大了,先问问有没有表达过这么大的蛋白的先例。
2楼2011-01-18 22:49:23
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★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-01-19 09:40:02
xucan0901(金币+1): 2011-01-19 10:12:40
主要是两个问题,密码子偏爱性和蛋白分子量太大。
3楼2011-01-18 22:57:56
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小虫子666

铁杆木虫 (正式写手)


★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-01-19 09:40:13
xucan0901(金币+1): 2011-01-19 10:12:46
xucan0901(金币+2): 谢谢你,我也想用Rosetta(DE3)试试。 2011-01-19 10:17:30
稀有密码子多的话 Rosetta(DE3)菌株 可以试试,我的是66kda的用普通的BL21做不出来,Rosetta(DE3)一次就成功了。值得一试
4楼2011-01-19 09:23:32
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