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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】测序问题：PCR产物未纯化测序会怎样？
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】测序问题：PCR产物未纯化测序会怎样？ 已有7人参与

之前送了一些PCR未纯化产物去公司测序，不知道是不是忘了标明，在收费单上显示是纯化产物测序，看了下大部分图谱都很正常，不知道是公司弄错了，还是确实影响不大。少数有不大严重套峰的情况如下图，基本也能判读，弄不清是产物条带不单一还是未纯化引起的，麻烦大家帮看看。

[ Last edited by lhm_hnyj on 2010-12-20 at 11:59 ]
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1楼 2010-12-20 11:52:07
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-20 15:40:57
引用回帖:
Originally posted by lhm_hnyj at 2010-12-20 11:52:07:
之前送了一些PCR未纯化产物去公司测序，不知道是不是忘了标明，在收费单上显示是纯化产物测序，看了下大部分图谱都很正常，不知道是公司弄错了，还是确实影响不大。少数有不大严重套峰的情况如下图，基本也能判读 ...

其实对于一般克隆来说，PCR产物测序是可以的，然后看看同源性。但是如果对测序结果很严格，比如做点突变，那就需要用高保真Taq酶扩增，然后连T载体后测序，这样测得结果比单纯PCR产物要准确很多！
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2楼2010-12-20 11:55:06
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by guoxingjun2008 at 2010-12-20 11:55:06:



其实对于一般克隆来说，PCR产物测序是可以的，然后看看同源性。但是如果对测序结果很严格，比如做点突变，那就需要用高保真Taq酶扩增，然后连T载体后测序，这样测得结果比单纯PCR产物要准确很多！

哦，您的意思我明白了。这里我是不大清楚PCR产物未经过纯化直接测序会有什么后果，峰图上有什么表现？
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3楼2010-12-20 12:02:39
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ben1147

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+2):good 2010-12-20 15:41:11
PCR产物最好电泳检测一下，如果有非特异带就一定要切胶之后再测
即使没有非特异带，也可能有非特异扩增产物，量很少，胶上看不出来，但是测序的时候有可能被作为模板得到扩增，最后色谱图上就有套峰，影响序列的判读
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4楼2010-12-20 14:51:13
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-20 17:51:31
一般纯化以后测比较准确！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2010-12-20 16:12:59
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-20 17:51:40
纯化后测比较准确！防止非特异扩增产物的干扰。
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6楼2010-12-20 17:46:13
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2010-12-20 17:46:13:
纯化后测比较准确！防止非特异扩增产物的干扰。

在送测序单上注明是未纯化产物，公司就会割胶回收后再测序。这次我无法确定
他们是否经过了割胶这步，按结果单上写的应该是没有。如果没有的话，大部分结果都非常正常，不知道是不是这次的产物比较好，刚好就不影响检测？
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7楼2010-12-20 18:04:07
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-21 08:24:57
一般说来，pcr产物测序都需要纯化，是为了得到更好的测序结果，尤其是当pcr产物有非特异性条带，或者你的引物有dimer干扰的情况下。当让，随着测序技术的不断优化，这些都不是问题，和机器有很大的关联。。。
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会当凌绝顶，一览众山小
8楼2010-12-20 20:48:29
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怎么都行

银虫 (小有名气)
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-21 08:25:09
PCR产物如果条带唯一，那直接送测序也没什么问题
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9楼2010-12-21 00:07:48
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
谢谢各位了哈
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10楼2010-12-21 08:19:27
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