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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】测序问题:PCR产物未纯化测序会怎样? 已有7人参与

之前送了一些PCR未纯化产物去公司测序,不知道是不是忘了标明,在收费单上显示是纯化产物测序,看了下大部分图谱都很正常,不知道是公司弄错了,还是确实影响不大。少数有不大严重套峰的情况如下图,基本也能判读,弄不清是产物条带不单一还是未纯化引起的,麻烦大家帮看看。

[ Last edited by lhm_hnyj on 2010-12-20 at 11:59 ]
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)

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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-20 15:40:57
引用回帖:
Originally posted by lhm_hnyj at 2010-12-20 11:52:07:
之前送了一些PCR未纯化产物去公司测序,不知道是不是忘了标明,在收费单上显示是纯化产物测序,看了下大部分图谱都很正常,不知道是公司弄错了,还是确实影响不大。少数有不大严重套峰的情况如下图,基本也能判读 ...

其实对于一般克隆来说,PCR产物测序是可以的,然后看看同源性。但是如果对测序结果很严格,比如做点突变,那就需要用高保真Taq酶扩增,然后连T载体后测序,这样测得结果比单纯PCR产物要准确很多!
2楼2010-12-20 11:55:06
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by guoxingjun2008 at 2010-12-20 11:55:06:



其实对于一般克隆来说,PCR产物测序是可以的,然后看看同源性。但是如果对测序结果很严格,比如做点突变,那就需要用高保真Taq酶扩增,然后连T载体后测序,这样测得结果比单纯PCR产物要准确很多!

哦,您的意思我明白了。这里我是不大清楚PCR产物未经过纯化直接测序会有什么后果,峰图上有什么表现?
3楼2010-12-20 12:02:39
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ben1147

木虫 (正式写手)

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dhd997(金币+2):good 2010-12-20 15:41:11
PCR产物最好电泳检测一下,如果有非特异带就一定要切胶之后再测
即使没有非特异带,也可能有非特异扩增产物,量很少,胶上看不出来,但是测序的时候有可能被作为模板得到扩增,最后色谱图上就有套峰,影响序列的判读
4楼2010-12-20 14:51:13
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-20 17:51:31
一般纯化以后测比较准确!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2010-12-20 16:12:59
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-20 17:51:40
纯化后测比较准确!防止非特异扩增产物的干扰。
6楼2010-12-20 17:46:13
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2010-12-20 17:46:13:
纯化后测比较准确!防止非特异扩增产物的干扰。

在送测序单上注明是未纯化产物,公司就会割胶回收后再测序。这次我无法确定
他们是否经过了割胶这步,按结果单上写的应该是没有。如果没有的话,大部分结果都非常正常,不知道是不是这次的产物比较好,刚好就不影响检测?
7楼2010-12-20 18:04:07
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader

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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-21 08:24:57
一般说来,pcr产物测序都需要纯化,是为了得到更好的测序结果,尤其是当pcr产物有非特异性条带,或者你的引物有dimer干扰的情况下。当让,随着测序技术的不断优化,这些都不是问题,和机器有很大的关联。。。
会当凌绝顶,一览众山小
8楼2010-12-20 20:48:29
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怎么都行

银虫 (小有名气)

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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-21 08:25:09
PCR产物如果条带唯一,那直接送测序也没什么问题
9楼2010-12-21 00:07:48
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

谢谢各位了哈
10楼2010-12-21 08:19:27
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