应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】在5'端挂一个尾巴
141/1返回列表
查看: 1516  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】在5'端挂一个尾巴

为了将两对引物扩增后,电泳跑的条带区分开,我想在其中一条引物的5'端挂一段其他物种的序列,但是不知道怎么找这样的序列?
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2010-12-17 20:25:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
神马？看不懂你的问题~~能不能详细解释下实验目的
赞一下 回复此楼
2楼2010-12-17 20:56:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
或者我理解的不对， 能不能一次扩增一个引物？
赞一下 回复此楼
3楼2010-12-17 20:58:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-12-17 20:58:38:
或者我理解的不对， 能不能一次扩增一个引物？

这个当然是可以的,我只是想优化下,争取一次PCR 加一次电泳 就可以区分开条带...
赞一下 回复此楼
4楼2010-12-17 21:22:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-17 20:56:44:
神马？看不懂你的问题~~能不能详细解释下实验目的

是这样的,这两对引物扩增的产物大小是一样的,我想在其中一条引物上加个尾巴之类的,已达到在电泳时候在同一泳道上能区分开条带的目的?
赞一下 回复此楼
5楼2010-12-17 21:25:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-12-17 23:15:27
xwsooo(金币+1):谢谢啦 2010-12-18 09:42:59
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-17 21:25:40:

是这样的,这两对引物扩增的产物大小是一样的,我想在其中一条引物上加个尾巴之类的,已达到在电泳时候在同一泳道上能区分开条带的目的?

这个看你目的片段多大以及跑什么样的胶了。因为引物上虽然可以附加序列，但是毕竟就那么几十bp，如果本身片段好几百上k，跑的是琼脂糖胶的话，附加的这点长度肯定看不出来或者很难分辨。要是本身扩增的条带很短，二、三百左右，引物再长个几十，用PAGE跑应该是能分开的

不知道你要这样分开的目的是什么。如果仅仅是凑巧两对引物扩增产物一样长的话重新设计一下引物，改变其中一对的扩增长度不就行了么。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2010-12-17 22:53:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-12-17 22:53:01:


这个看你目的片段多大以及跑什么样的胶了。因为引物上虽然可以附加序列，但是毕竟就那么几十bp，如果本身片段好几百上k，跑的是琼脂糖胶的话，附加的这点长度肯定看不出来或者很难分辨。要是本身扩增的条带很 ...

我明白您的意思，重新设计引物我也想过，但是这引物真不好弄到合适的，在primer-blast特异性好的就找到现在这样的了，我的目的产物在140bp 左右，跑琼脂糖凝胶。。。这尾巴的长度应该有所限制吧？怎么样设计才不影响引物本身，又不会使这 尾巴与目的序列以外的片断非特异性结合呢？？/
赞一下 回复此楼
7楼2010-12-18 09:46:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-17 21:25:40:

是这样的,这两对引物扩增的产物大小是一样的,我想在其中一条引物上加个尾巴之类的,已达到在电泳时候在同一泳道上能区分开条带的目的?

首先这个产物的片段不能太大，我估计假设200bp以下应该能做到

很简单，把其中一对引物接长，无论什么序列都可以，你可以大胆地各接长10nt

然后只能跑PAGE胶了，因为琼脂糖分50bp以下的条带就很困难了，容易误判

现在你只是差别20bp。再长可能会严重影响扩增效率
赞一下 回复此楼
8楼2010-12-18 10:02:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
xwsooo(金币+1):灰常感谢 2010-12-18 11:38:31
如果你怕非特异，加上GC clamp
或者形成茎环结构
加茎环结构能够接更长，估计上20nt应该没问题
这样两侧加起来就有40bp了，跑3%甚至5%的琼脂糖应该能和你的140分开
赞一下 回复此楼
9楼2010-12-18 10:04:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-18 10:04:46:
如果你怕非特异，加上GC clamp
或者形成茎环结构
加茎环结构能够接更长，估计上20nt应该没问题
这样两侧加起来就有40bp了，跑3%甚至5%的琼脂糖应该能和你的140分开

谢谢您的解释，形成茎环结构是什么意思？两侧都加？
赞一下 回复此楼
10楼2010-12-18 11:40:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
xwsooo(金币+1):谢谢 2010-12-18 15:47:16
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-18 11:40:39:

谢谢您的解释，形成茎环结构是什么意思？两侧都加？

茎环结构的话，你可以参考miRNA实时定量的逆转录引物

在5端加个茎环，3端不用
正向和反向的引物都加，就能延长很多了
赞一下 回复此楼
11楼2010-12-18 12:57:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yydopcr

铜虫 (小有名气)
xwsooo(金币+1):谢谢 2010-12-18 15:47:08
有点儿问题，第一加了之后引物变长，很容易有不可预测的二聚体和非特异扩增。其次琼脂糖电泳虽然理论可以分开，但是实际操作有难度，聚丙烯酰胺凝胶电泳倒是可以。
如果实验室有条件，建议用real-time吧看melting curve，用sybegreen 或者syto9，很经济的
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-17 20:25:01:
为了将两对引物扩增后,电泳跑的条带区分开,我想在其中一条引物的5'端挂一段其他物种的序列,但是不知道怎么找这样的序列?

赞一下 回复此楼
12楼2010-12-18 13:05:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-18 12:57:34:


茎环结构的话，你可以参考miRNA实时定量的逆转录引物

在5端加个茎环，3端不用
正向和反向的引物都加，就能延长很多了

miRNA实时定量的逆转录引物这个对于我来说不懂
赞一下 回复此楼
13楼2010-12-18 15:47:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yydopcr at 2010-12-18 13:05:59:
有点儿问题，第一加了之后引物变长，很容易有不可预测的二聚体和非特异扩增。其次琼脂糖电泳虽然理论可以分开，但是实际操作有难度，聚丙烯酰胺凝胶电泳倒是可以。
如果实验室有条件，建议用real-time吧看meltin ...

您说的是HRM吧？不知道roche的480做这个效果怎么样？sybegreen 或者syto9
是非饱和染料吧？
赞一下 回复此楼
14楼2010-12-18 15:49:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xwsooo 的主题更新
141/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭