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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】在5'端挂一个尾巴

为了将两对引物扩增后,电泳跑的条带区分开,我想在其中一条引物的5'端挂一段其他物种的序列,但是不知道怎么找这样的序列?
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1楼 2010-12-17 20:25:01
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
神马？看不懂你的问题~~能不能详细解释下实验目的
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2楼2010-12-17 20:56:44
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
或者我理解的不对， 能不能一次扩增一个引物？
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3楼2010-12-17 20:58:38
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-12-17 20:58:38:
或者我理解的不对， 能不能一次扩增一个引物？

这个当然是可以的,我只是想优化下,争取一次PCR 加一次电泳 就可以区分开条带...
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4楼2010-12-17 21:22:59
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-17 20:56:44:
神马？看不懂你的问题~~能不能详细解释下实验目的

是这样的,这两对引物扩增的产物大小是一样的,我想在其中一条引物上加个尾巴之类的,已达到在电泳时候在同一泳道上能区分开条带的目的?
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5楼2010-12-17 21:25:40
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-12-17 23:15:27
xwsooo(金币+1):谢谢啦 2010-12-18 09:42:59
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-17 21:25:40:

是这样的,这两对引物扩增的产物大小是一样的,我想在其中一条引物上加个尾巴之类的,已达到在电泳时候在同一泳道上能区分开条带的目的?

这个看你目的片段多大以及跑什么样的胶了。因为引物上虽然可以附加序列，但是毕竟就那么几十bp，如果本身片段好几百上k，跑的是琼脂糖胶的话，附加的这点长度肯定看不出来或者很难分辨。要是本身扩增的条带很短，二、三百左右，引物再长个几十，用PAGE跑应该是能分开的

不知道你要这样分开的目的是什么。如果仅仅是凑巧两对引物扩增产物一样长的话重新设计一下引物，改变其中一对的扩增长度不就行了么。
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6楼2010-12-17 22:53:01
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-12-17 22:53:01:


这个看你目的片段多大以及跑什么样的胶了。因为引物上虽然可以附加序列，但是毕竟就那么几十bp，如果本身片段好几百上k，跑的是琼脂糖胶的话，附加的这点长度肯定看不出来或者很难分辨。要是本身扩增的条带很 ...

我明白您的意思，重新设计引物我也想过，但是这引物真不好弄到合适的，在primer-blast特异性好的就找到现在这样的了，我的目的产物在140bp 左右，跑琼脂糖凝胶。。。这尾巴的长度应该有所限制吧？怎么样设计才不影响引物本身，又不会使这 尾巴与目的序列以外的片断非特异性结合呢？？/
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7楼2010-12-18 09:46:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-17 21:25:40:

是这样的,这两对引物扩增的产物大小是一样的,我想在其中一条引物上加个尾巴之类的,已达到在电泳时候在同一泳道上能区分开条带的目的?

首先这个产物的片段不能太大，我估计假设200bp以下应该能做到

很简单，把其中一对引物接长，无论什么序列都可以，你可以大胆地各接长10nt

然后只能跑PAGE胶了，因为琼脂糖分50bp以下的条带就很困难了，容易误判

现在你只是差别20bp。再长可能会严重影响扩增效率
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8楼2010-12-18 10:02:46
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
xwsooo(金币+1):灰常感谢 2010-12-18 11:38:31
如果你怕非特异，加上GC clamp
或者形成茎环结构
加茎环结构能够接更长，估计上20nt应该没问题
这样两侧加起来就有40bp了，跑3%甚至5%的琼脂糖应该能和你的140分开
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9楼2010-12-18 10:04:46
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-18 10:04:46:
如果你怕非特异，加上GC clamp
或者形成茎环结构
加茎环结构能够接更长，估计上20nt应该没问题
这样两侧加起来就有40bp了，跑3%甚至5%的琼脂糖应该能和你的140分开

谢谢您的解释，形成茎环结构是什么意思？两侧都加？
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10楼2010-12-18 11:40:39
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
xwsooo(金币+1):谢谢 2010-12-18 15:47:16
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-18 11:40:39:

谢谢您的解释，形成茎环结构是什么意思？两侧都加？

茎环结构的话，你可以参考miRNA实时定量的逆转录引物

在5端加个茎环，3端不用
正向和反向的引物都加，就能延长很多了
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11楼2010-12-18 12:57:34
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yydopcr

铜虫 (小有名气)
xwsooo(金币+1):谢谢 2010-12-18 15:47:08
有点儿问题，第一加了之后引物变长，很容易有不可预测的二聚体和非特异扩增。其次琼脂糖电泳虽然理论可以分开，但是实际操作有难度，聚丙烯酰胺凝胶电泳倒是可以。
如果实验室有条件，建议用real-time吧看melting curve，用sybegreen 或者syto9，很经济的
引用回帖:
Originally posted by xwsooo at 2010-12-17 20:25:01:
为了将两对引物扩增后,电泳跑的条带区分开,我想在其中一条引物的5'端挂一段其他物种的序列,但是不知道怎么找这样的序列?

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12楼2010-12-18 13:05:59
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-12-18 12:57:34:


茎环结构的话，你可以参考miRNA实时定量的逆转录引物

在5端加个茎环，3端不用
正向和反向的引物都加，就能延长很多了

miRNA实时定量的逆转录引物这个对于我来说不懂
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13楼2010-12-18 15:47:59
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yydopcr at 2010-12-18 13:05:59:
有点儿问题，第一加了之后引物变长，很容易有不可预测的二聚体和非特异扩增。其次琼脂糖电泳虽然理论可以分开，但是实际操作有难度，聚丙烯酰胺凝胶电泳倒是可以。
如果实验室有条件，建议用real-time吧看meltin ...

您说的是HRM吧？不知道roche的480做这个效果怎么样？sybegreen 或者syto9
是非饱和染料吧？
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14楼2010-12-18 15:49:27
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