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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】测序问题
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kakaqa

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】测序问题

最近一直在做连接转化，3000bp左右的片段用pMD18-T easy vector连，之前一直连不上，现在好了，有几个连上的，大小也差不多，可是测序结果确是在一开始两个引物就连在一起，在末端还有引物，最后比对结果是载体序列，请问这是为什么啊，难道是引物自连了，还是测序的问题？请高手指教！
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1楼 2010-12-08 09:15:38
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adslye

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
kakaqa(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2):鼓励积极参与~~~ 2010-12-08 10:33:01
引用回帖:
Originally posted by kakaqa at 2010-12-08 09:15:38:
最近一直在做连接转化，3000bp左右的片段用pMD18-T easy vector连，之前一直连不上，现在好了，有几个连上的，大小也差不多，可是测序结果确是在一开始两个引物就连在一起，在末端还有引物，最后比对结果是载体序 ...

我也是新手，谈谈我的看法。给你顶一下。
你说的引物是测序引物还是PCR引物？
如果是PCR引物，你的意思是测序发现两个引物连到一起了？然后后面接着载体序列，后面还有PCR引物？
好诡异，如果这样我也不知道是怎么来的。。。我感觉以上理解不对。

如果是测序引物，是不是载体自连了。。。

诡异，重新测序看下吧。我没出现过这样的情况。上海英俊测的。
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2楼2010-12-08 09:49:41
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pidou213

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
kakaqa(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2):鼓励积极参与~~~ 2010-12-08 10:33:08
请确保，
1、目的片段是纯的，无污染的，在3000bp的，希望你能切胶后回收在电泳检测一下
2、连接不成功的可能性为载体与目的片段的比例不合适，每个试剂盒都有规定的最佳比例，请用紫外或者marker的目测结果，来配制载体和目的片段的加入量。从而达到最优化，希望楼主试一试
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3楼2010-12-08 09:56:18
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kakaqa

铜虫 (初入文坛)

关于测序问题

引用回帖:
Originally posted by adslye at 2010-12-08 09:49:41:
    我也是新手，谈谈我的看法。给你顶一下。
你说的引物是测序引物还是PCR引物？
如果是PCR引物，你的意思是测序发现两个引物连到一起了？然后后面接着载体序列，后面还有PCR引物？
好诡异，如果这样我也不知 ...

是我的PCR引物，我也感觉很郁闷的，我怀疑是测序的问题，其实我以前也遇到过这种问题，不过因为当时只有1个样是，其他的都正确就没有在意，可是这次全是这样的，我是在华大测的，师兄建议我送生工测下。
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4楼2010-12-08 09:59:13
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
kakaqa(金币+1):谢谢参与
估计还是没连接上吧，不知道lz怎么确定连接上了？
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5楼2010-12-08 10:01:54
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adslye

银虫 (正式写手)
TA连接应该很容易成功，长出来的基本都是。起码我做的是这样。。。愿楼主好运，只能重复了。
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6楼2010-12-08 10:09:40
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kakaqa

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by gongeleven at 2010-12-08 10:01:54:
估计还是没连接上吧，不知道lz怎么确定连接上了？

通过菌液PCR检测，条带大小跟我要的大小一样。
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7楼2010-12-08 10:36:19
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
kakaqa(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-08 11:05:16
3000bp，不算短了，可能不太好连。
你如果已经做了克隆，测序使用通用引物比较好
另外一开始就出现两个引物，这种可能也不是不存在，你的引物是否存在二聚体，如果有很厉害的二聚体，还是有可能出现这种情况的，不过你的测序结果应该看到的是两个引物搭起来的情况
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8楼2010-12-08 10:37:29
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bin86

金虫 (小有名气)
★
kakaqa(金币+1):谢谢参与
学习一下
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9楼2010-12-08 20:53:47
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