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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】southern杂交求助！
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2009103158

新虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】southern杂交求助！

本人正在做植物基因组的southern杂交以确定外源基因的拷贝数，用的是ROCHE的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I。今天出了结果，十分郁闷，只有marker和阳性对照显色了，样品没有颜色。请看附图，跪求高人相助！！！

上图为提取的基因组DNA，以Hind111为marker

上图为酶切基因组后取出的5ul样跑胶看基因组是否被酶切完全，酶切体系为100ul

上图为转膜结束后检验转磨是否完全，残留的片段是较大的片段

上图为刚刚出来的结果，只有DNA marker和阳性对照显色，样品没有一个显色的
忙碌了一星期，却没有得到结果，十分郁闷，请经验人士给予帮助！！！
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1楼 2010-11-28 15:42:42
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)
2009103158(金币+1): 2011-02-11 20:13:00
从你的酶切产物跑胶结果来看，你的基因组DNA降解了，因为你的条带不是上面亮下边暗，就是正好相反，高质量的基因组DNA酶切出来跑胶后是均匀的一片
1



2



3



好的酶切，电泳效果应该是这样，其中主要取决于DNA质量的好坏
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2楼2010-11-28 17:07:14
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马马和虎虎

新虫 (小有名气)
★
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请问，Marker为什么可以显色啊？
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6楼2011-12-27 18:44:33
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普通回帖

Sureking

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2010-11-28 17:07:14:
从你的酶切产物跑胶结果来看，你的基因组DNA降解了，因为你的条带不是上面亮下边暗，就是正好相反，高质量的基因组DNA酶切出来跑胶后是均匀的一片
1

[img]http://pic.muchong.com/201011/28/849017_170602.jpg[ ...

下面亮的应该是没有除去的rna吧
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3楼2011-11-19 20:59:36
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mascotte

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-12-27 17:30:49
没做过生物素标记的探针，只做过同位素标记的，同位素标记探针的敏感度大大高于生物素；
探针长度不够的话杂交的效果也不好，我一般用长度大于500bp的探针；
探针的类型不一样的话（DNA or RNA），杂交的温度也有区别；
膜的选择应该符合样品和探针的类型；
最后，杂交液中的硫酸葡聚糖能够提高信号强度，但是太多了背景会脏。

Good Luck！
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4楼2011-11-19 22:26:00
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baiyongqin

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wanhscn(金币+6): 鼓励交流！Good！ 2011-12-27 17:31:18
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2011-12-27 17:38:54
内容已删除
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5楼2011-12-27 16:50:10
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刁寒冰

银虫 (小有名气)
★
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请问楼主，试剂盒在哪买的呢？我实验室之前都没人做过这个，有点感觉无所适从!
试剂盒有好几种吧？怎么选择自己需要的呢？
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7楼2012-06-04 21:32:10
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happygjx

木虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
1967307楼: Originally posted by 刁寒冰 at 2012-06-04 21:32:10
请问楼主，试剂盒在哪买的呢？我实验室之前都没人做过这个，有点感觉无所适从!
试剂盒有好几种吧？怎么选择自己需要的呢？

一般都用GE的试剂盒（国药）打8折后RMB5000左右
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8楼2012-07-21 10:16:08
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刁寒冰

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
1947597楼: Originally posted by baiyongqin at 2011-12-27 16:50:10
我也遇到过很多次的同样情况，很明显，你的DNA降解很严重，而且有严重的DNA污染。因为你的阳性对照很清晰，背景也很清楚，说明probe是没问题的，只是DNA 出问题了。建议改善DNA 的质量，祝好运！可以给你参考一下我 ...

请问marker怎么会显色呢？很奇怪
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9楼2012-09-14 13:00:28
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刁寒冰

银虫 (小有名气)
引用回帖:
349008楼: Originally posted by 2009103158 at 2010-11-28 15:42:42
本人正在做植物基因组的southern杂交以确定外源基因的拷贝数，用的是ROCHE的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I。今天出了结果，十分郁闷，只有marker和阳性对照显色了，样品没有颜色。请看附 ...

请问楼主，DNA marker怎么会显色呢？
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10楼2012-09-14 13:01:34
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yuliangju2

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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1977478楼: Originally posted by 刁寒冰 at 2012-09-14 13:01:34
请问楼主，DNA marker怎么会显色呢？...

因为marker也是dig标记过的
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11楼2013-03-28 09:41:48
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电泳王子

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by baiyongqin at 2011-12-27 16:50:10
我也遇到过很多次的同样情况，很明显，你的DNA降解很严重，而且有严重的DNA污染。因为你的阳性对照很清晰，背景也很清楚，说明probe是没问题的，只是DNA 出问题了。建议改善DNA 的质量，祝好运！可以给你参考一下我 ...

请问marker怎么标记的呢？DNA的量是多少？探针浓度和洗脱时间控制在多少呢？
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12楼2013-11-05 09:23:36
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cutewm

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by baiyongqin at 2011-12-27 16:50:10
我也遇到过很多次的同样情况，很明显，你的DNA降解很严重，而且有严重的DNA污染。因为你的阳性对照很清晰，背景也很清楚，说明probe是没问题的，只是DNA 出问题了。建议改善DNA 的质量，祝好运！可以给你参考一下我 ...

你好，我有个实验，现在需要做这个southern blot我做了很久做不出来，一直在摸索条件，请问你有木有方法，可以让我们参考一下，因为我觉得你做的很棒。我们也可以资源共享别的，如果你需要的话，我们正好也有，我是南开生科院内质网课题组。谢谢
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13楼2015-10-26 17:01:36
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