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worm2010

金虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】引物设计的问题，大侠们来帮帮忙~谢谢了已有4人参与

用oligo6设计引物后，假如还想在这对引物两侧各加一个酶切位点的话，会不会影响最初设计的退火温度以及二聚体产生呢？如果影响怎么办呀？应该怎么设计呢？大家来讨论一下吧，我是菜鸟啊，最近PCR总也P不出东西来，郁闷死了

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1楼 2010-11-25 22:04:54

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fjt198719

木虫 (著名写手)

永远的菜鸟

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★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):辛苦，好多字 2010-11-26 09:45:34

普通PCR的话，建议LZ做个Touchdown PCR，找到最佳退火温度来扩增，一般与软件和合成引物单上写的没啥关系。
本人从来不计算TM值，因为一般都是直接把目的基因全部扩增出来，设计引物都是直接手写，酶切位点当然要用软件分析下才选择的（载体上有，目的基因上无，双酶切效果好点的），扩增200-3000片段全部没得问题。SOE-PCR也没的问题，就是直接融合5个片段也没的问题，设计的中间融合引物都是50bp跟30bp的引物一起扩增，刚刚的（这里引物合成单上写的50bp的引物退火温度都是80度左右，30bp的是65左右，而我扩增的退火温度是57度，可以看出来单子上写的没用）。
本人粗略认为退火温度只与目的菌株的GC含量有关