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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR产物电泳检测已有11人参与

提取的DNA琼脂糖凝胶电泳检测是有荧光亮带的,而PCR扩增800bp目的基因,扩增产物却没有出现亮带,Marker跑出来了,只是样品都没有亮带。扩增 程序都是参考文献上面的,扩增引物也是新合成的,怎么回事呢?我是前一天晚上扩增的,因太晚没有时间立即电泳检测,是放在-20度冰箱放置过夜,第二天电泳检测的,我想这样没有什么影响吧?为什么扩不出来呢?
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

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Originally posted by zhaohq1209 at 2010-11-25 22:50:58:

有没有加阳性对照保证扩增体系和条件正确?

哦,没有哦,不太懂这方面的,阳性对照是怎么设计的呢?用Marker做DNA模板?
3楼2010-11-25 22:58:42
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金虫 (小有名气)

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Originally posted by 天使托 at 2010-11-25 23:10:58:
一般的pcr产物可以放好几天呢,你这没有条带就奇怪了,可能本身就没有扩增出来!再试试!

恩,你知道阳性对照怎么设计的吗?谢谢!
6楼2010-11-25 23:14:20
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2010-11-25 23:27:22:


你pcr是做什么用?是单纯扩增基因还是做别的东西,如果只是扩增基因就不用对照,只需要看你扩增出来的条带大小是否符合当时引物设计时的大小,当时如果是做基因敲除的话,阳性对照肯定是必须滴!

我提取的是基因组的DNA,然后想通过PCR,将目的基因扩出来,然后再进行变性梯度凝胶电泳,这需要阳性对照吗?怎么设计的呢?谢谢
9楼2010-11-26 11:23:50
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

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Originally posted by 天使托 at 2010-11-26 11:33:24:


你是用基因组的DNA作为模板进行扩增吗?如果是的话就不需要对照了,只需要看扩增出来的目的基因的大小正确就行了!

恩,我是用基因组的DNA作为模板的,可是没有扩增出来,问题会出在哪里呢?
12楼2010-11-26 13:35:31
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

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Originally posted by wsc0451 at 2010-11-26 11:34:12:
十有八九就是根本没扩增出来了。。。当然最好还是做个阳性对照看下。。。

阳性对照怎么设计的呢?用什么做模板呢?
13楼2010-11-26 13:36:04
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金虫 (小有名气)

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Originally posted by aga0110125 at 2010-11-26 15:26:50:
PCR的阳性对照就是PCR一定能扩出目的条带的反应体系
在你这里,就是一定包含你目的片段的DNA,如确定含有你目的片段的基因组DNA
PS:不要太相信参考文献所给的数据,至少在合成引物前,先拿引物序列去和目的片段 ...

包含目的片段的DNA ?我做的是巢式PCR,第一轮扩800bp,第二轮扩230bp.现在的问题是第一轮800bp都没有扩出来,要是阳性对照扩出来的话是我的模板的问题,要是没有扩出来的话是体系和程序的问题,对吗?那个包含目的片段的DNA用含800bp的Marker?是新手,不太懂这方面的,谢谢指导
15楼2010-11-26 16:29:02
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piaoyuaaa

金虫 (小有名气)

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Originally posted by xudan667 at 2010-11-26 17:11:08:
有没有加阳性对照?

阳性对照怎么设计啊,怎么找到肯定包含目的片段的基因呢?我是新手,对这方面不懂哦。谢谢
19楼2010-11-28 17:24:15
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