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小丁山

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】提高表达蛋白含量 已有5人参与

我用转化的大肠杆菌来收集表达的胆盐水解酶,但是每200ml培养液中收集到的却只有几十微克,具体操作是先试管中过夜培养,然后8ml接种至200ml,培养至OD600约0.5-0.6,加IPTG诱导表达4h,然后离心醇沉,上清:甲醇2:1,醇沉1h,离心收集沉淀,但是几乎没有,用考马斯亮兰法测总蛋白含量约为50微克每毫升左右,如何提高这个蛋白产量呢
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rtli1672

金虫 (著名写手)

表达量似乎还可以高点


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
看起来你的蛋白是表达后分泌到细胞外的,可以试试不同OD600条件,加长表达时间,另外,不知道IPTG加了多少,有时候IPTG可以多加点才能表达的。
2楼2010-09-26 09:45:48
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小丁山

铜虫 (小有名气)

IPTG 浓度是0.1mM,试图达到2倍IPTG的量,并没有很明显的提高
3楼2010-09-26 09:53:04
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liyan66007

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
做优化,优化诱导时机、培养基、IPTG的浓度、诱导时间,每种都可以做上百个样;或者换个载体试试
4楼2010-09-26 12:43:40
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liyan66007

木虫 (正式写手)

做生物急不得的,要有耐心
5楼2010-09-26 12:44:09
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粉靛蓝

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
首先你要把这个菌的生长曲线测出来,确定对数生长期,这样才能选择最佳的诱导时间,像你这种需要提高表达量的,是一个十分庞大的工程,并不是简单搞搞就能搞定的,还有你要确定下你这个是胞外酶吗?多数工程菌都产生胞内酶。
6楼2010-09-26 13:03:04
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粉靛蓝

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by rtli1672 at 2010-09-26 09:45:48:
看起来你的蛋白是表达后分泌到细胞外的,可以试试不同OD600条件,加长表达时间,另外,不知道IPTG加了多少,有时候IPTG可以多加点才能表达的。

并不是IPTG越高越好,有的菌需要低浓度的IPTG诱导,你需要考察。
7楼2010-09-26 13:04:35
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小丁山

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 粉靛蓝 at 2010-09-26 13:04:35:

并不是IPTG越高越好,有的菌需要低浓度的IPTG诱导,你需要考察。

这项已经考察过了,一半含量和2倍量的IPTG没有明显的效果
8楼2010-09-26 13:31:27
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小丁山

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 粉靛蓝 at 2010-09-26 13:03:04:
首先你要把这个菌的生长曲线测出来,确定对数生长期,这样才能选择最佳的诱导时间,像你这种需要提高表达量的,是一个十分庞大的工程,并不是简单搞搞就能搞定的,还有你要确定下你这个是胞外酶吗?多数工程菌都产 ...

这个工作在之前已经完成,生长至0.5-0.6就达到了对数期,这个课题已经进行了大半年了,这边表达提取顺利就可以结题了
9楼2010-09-26 13:34:52
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小丁山

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by liyan66007 at 2010-09-26 12:43:40:
做优化,优化诱导时机、培养基、IPTG的浓度、诱导时间,每种都可以做上百个样;或者换个载体试试

这些都已经考察过了,我还加入底物,给菌体一定选择压力,有一些效果
10楼2010-09-26 13:36:47
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