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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】提高表达蛋白含量
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小丁山

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】提高表达蛋白含量 已有5人参与

我用转化的大肠杆菌来收集表达的胆盐水解酶，但是每200ml培养液中收集到的却只有几十微克，具体操作是先试管中过夜培养，然后8ml接种至200ml，培养至OD600约0.5-0.6，加IPTG诱导表达4h，然后离心醇沉，上清：甲醇2：1，醇沉1h，离心收集沉淀，但是几乎没有，用考马斯亮兰法测总蛋白含量约为50微克每毫升左右，如何提高这个蛋白产量呢
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1楼 2010-09-26 09:32:38
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rtli1672

金虫 (著名写手)

表达量似乎还可以高点

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看起来你的蛋白是表达后分泌到细胞外的，可以试试不同OD600条件，加长表达时间，另外，不知道IPTG加了多少，有时候IPTG可以多加点才能表达的。
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2楼2010-09-26 09:45:48
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小丁山

铜虫 (小有名气)
IPTG 浓度是0.1mM，试图达到2倍IPTG的量，并没有很明显的提高
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3楼2010-09-26 09:53:04
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liyan66007

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
做优化，优化诱导时机、培养基、IPTG的浓度、诱导时间，每种都可以做上百个样；或者换个载体试试
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4楼2010-09-26 12:43:40
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liyan66007

木虫 (正式写手)
做生物急不得的，要有耐心
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5楼2010-09-26 12:44:09
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粉靛蓝

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
首先你要把这个菌的生长曲线测出来，确定对数生长期，这样才能选择最佳的诱导时间，像你这种需要提高表达量的，是一个十分庞大的工程，并不是简单搞搞就能搞定的，还有你要确定下你这个是胞外酶吗？多数工程菌都产生胞内酶。
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6楼2010-09-26 13:03:04
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粉靛蓝

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by rtli1672 at 2010-09-26 09:45:48:
看起来你的蛋白是表达后分泌到细胞外的，可以试试不同OD600条件，加长表达时间，另外，不知道IPTG加了多少，有时候IPTG可以多加点才能表达的。

并不是IPTG越高越好，有的菌需要低浓度的IPTG诱导，你需要考察。
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7楼2010-09-26 13:04:35
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小丁山

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 粉靛蓝 at 2010-09-26 13:04:35:

并不是IPTG越高越好，有的菌需要低浓度的IPTG诱导，你需要考察。

这项已经考察过了，一半含量和2倍量的IPTG没有明显的效果
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8楼2010-09-26 13:31:27
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小丁山

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 粉靛蓝 at 2010-09-26 13:03:04:
首先你要把这个菌的生长曲线测出来，确定对数生长期，这样才能选择最佳的诱导时间，像你这种需要提高表达量的，是一个十分庞大的工程，并不是简单搞搞就能搞定的，还有你要确定下你这个是胞外酶吗？多数工程菌都产 ...

这个工作在之前已经完成，生长至0.5-0.6就达到了对数期，这个课题已经进行了大半年了，这边表达提取顺利就可以结题了
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9楼2010-09-26 13:34:52
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小丁山

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liyan66007 at 2010-09-26 12:43:40:
做优化，优化诱导时机、培养基、IPTG的浓度、诱导时间，每种都可以做上百个样；或者换个载体试试

这些都已经考察过了，我还加入底物，给菌体一定选择压力，有一些效果
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10楼2010-09-26 13:36:47
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