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jack_1128

铁杆木虫 (正式写手)

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[求助] 血红蛋白四聚体二聚体高效液相和飞行时间质谱

大家好！

想请教一下，我想看看我的血红蛋白溶液中有没有二聚体，正常血红蛋白分子是以四聚体形式存在的，分子量为64000，可能会解聚成二聚体（分子量为32000），本来想跑电泳，但是一直是两条带都有，很奇怪

所以打算试试高效液相色谱或者飞行时间质谱

想问问大家飞行时间质谱会不会把血红蛋白打碎啊？

谢谢！！！

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烦躁已经有6人回复

1楼 2011-11-03 22:50:23

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宝鸡凤翔

铜虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

jack_1128(金币+10, 博学EPI+1): 非常感谢！！！ 2011-11-07 21:36:51

下面是类似文献的一部分，是可以用飞行时间质谱检测的，你好好看看吧，不过这个蛋白质选基质不容易的，呵呵！
3 结果与讨论

　　3.1 两种分析方法在蛋白质定性和定量分析上的比较

　　iTRAQ标记的多肽样品用QStar XL MS/MS和MALDITOFTOF进行了分析，通过比较获得的蛋白质定性和定量的实验数据发现，两者在定性和定量方面均存在显著差异。QStar XL MS/MS共鉴定到置信度>95%的蛋白质1481个，其中E2刺激前后差异在0.5倍以上的蛋白质33个。MALDITOFTOF鉴定到置信度>95%的蛋白质1719个，其中E2刺激前后差异在0.5倍以上的蛋白质38个。对两种仪器获得的数据进行对比发现，两种方法鉴定到的蛋白质中有633种是相同的; 找到上调或下调0.5倍以上的差异表达蛋白质中有3种是相同的。可见，MALDITOFTOF无论是在定性上还是在定量方面均较QStar XL MS/MS找到蛋白质多。文献[9]也得出过相似结论。这可能与MALDI采用了离线的液相色谱分离方式，而QStar XL MS/MS采用在线的LCMS/MS串联方式有关。MALDITOFTOF获得的子离子系列不仅离子强度较高，而且较为完整。

　　比较两种方法找到相同蛋白质的差异表达情况(表1)可见，蛋白质变化的方向是一致的，其中E2处理引起MCF7细胞中胰蛋白酶原C和1型胰蛋白酶的含量降低，引起细胞内EIF4A1的含量显著升高。其中用QStar XL获得的两种蛋白质下调的幅度和EIF4A1上调的幅度较MALDITOFTOF检测到的变化幅度大。对两种不同类型仪器获得的多肽串联图谱(图1)进行比较发现，用MALDITOFTOF分析获得的子离子强度较用QStar XL获得的子离子强度要高，得到的y离子序列较完整，这可能与MALDITOFTOF采用高能碰撞(High collision induced dissociation, HCD)以及检测灵敏度较高有关。QStar XL得到的b离子序列较MALDITOFTOF完整。根据文献[11，12]报道，这主要与碰撞诱导解离的方式有关。表1 用MALDITOFTOF 和QTOF找到的差异表达蛋白

　　3.2 两种分析方法在多肽鉴定分析上的比较

　　比较两种方法鉴定到置信度>95%的多肽发现，ESIMS/MS鉴定到1660种多肽，MALDITOFTOF鉴定到1169种多肽。其中1096种为ESIMS/MS独有，605种为MALDITOFTOF独有，564种为两种方法共有。此结果与以往MALDITOFTOF 鉴定多肽的数目显著高于QTOF的报道相反[9]。从结果可表2 用ESI QTOF和MALDITOFTOF鉴定到多肽的分子量比较

　　Peptide molecular weight (Mw)LowHighAverageMALDI0.042899.453789.071657.9ESI0.001399.218508.492028.2以看出两种技术路线结合起来能够显著提高多肽鉴定的覆盖率。通过比较两者鉴定到多肽的质量误差(表2)可见，用ESIMS/MS得到多肽的质量误差(平均为0.001 Da)低于用MALDITOFTOF得到多肽的质量误差(平均为0.042 Da)。这与ESIMS/MS采用了全过程内参自动校正功能而MALDITOFTOF只在MS方式下进行分析前的一次校正有关。ESIMS/MS得到多肽的分子量上限高于MALDITOFTOF的分子量上限，这与ESI的多价电荷产生功能有关，在本实验中，ESIMS/MS的检测范围设定在m/z 300～1680，而MALDITOFTOF设定为m/z 9004000，上述实验结果与文献[9]一致。

　　比较多肽的性质(表3)可以发现，ESIMS/MS和MALDITOFTOF方法鉴定到多肽的C末端为R的多肽较K为多，两者的K/R比率分别为0.83和0.85, 这与文献[9]的结果不同。这可能是由于文献[9]中分析的是大肠杆菌中的DNA结合蛋白(DNA结合蛋白大多为偏碱性的蛋白质)，而且多肽和蛋白质的数目均显著低于本研究所致。ESIMS/MS较MALDITOFTOF更易于疏水性多肽的离子化，这与文献[9]的结果相同。本研究中ESIMS/MS鉴定到的多肽共由163330个氨基酸残基组成，MALDITOFTOF方法鉴定到的多肽由82210个氨基酸残基组成。对不同氨基酸残基在总氨基酸数目中所占的比例进行比较(图2)发现，ESI倾向于离子化含疏水性氨基酸(A，F，G，I，L，P，V)较多的多肽，这与文献[3]报道的结论一致;MALDI倾向于离子化含酸性氨基酸(D，E，N，Q)以及含羟基基团(S，Y)的多肽，这一现象还未见报道。图2 不同氨基酸残基在用MALDITOFTOF和QTOF鉴定到的多肽中的比例

　　4 结论

　　在线LCESIMS/MS和离线的LCMALDIMS/MS是目前蛋白质组学研究中进行高通量定性和定量分析时最常采用的两种方法。本研究比较了LCESIQTOF(QSTAR XL)和LCMALDI/TOFTOF在蛋白鉴定和iTRAQ定量分析方面的性能。研究发现，MALDI有利于含酸性氨基酸和有羟基基团的多肽的离子化，这有待用更多的实验数据进行证实。

　　在蛋白质鉴定方面，尽管LCESIQTOF可鉴定到多肽的数目要明显多于MALDI/TOFTOF，但通过数据库搜索鉴定到蛋白质的数目却显著低于MALDI/TOFTOF。两种方法在蛋白质鉴定和定量方面有很大的互补性，将两种方法结合使用，将能够显著提高蛋白质定性和定量的覆盖率，分析出的交叉部分则有较高的置信度
http://www.studa.net/Clinical/110423/13253117-2.html