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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】3'RACE问题
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lijunping68

[交流] 【求助/交流】3'RACE问题

我做3'RACE做了两个多月了，可每次都出现弥散而且还有在700bp左右大小和1000bp左右大小有条带，不知道为什么会有弥散，回收酶切鉴定都正确，可是测序结果什么都不是，是什么原因呢？我想要的目的条带应该在1600bp左右，模板我鉴定过了，没什么问题，我设计的内外侧引物长度19bp和20bp，谢谢各位，帮帮我吧！

[ Last edited by lijunping68 on 2010-9-16 at 12:50 ]
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1楼 2010-09-16 11:06:49
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)
lijunping68(金币+1): 2010-09-16 12:49:05
lijunping68(金币+1): 2010-09-21 09:21:34
测序结果啥都不是是啥意思？不是你的目的基因吗？你的目的条带位置应该在1600左右，是加了3‘utr和PolyA之后的长度吗?如果不是的话，那么你的目的条带位置可能在2000左右呢。看看PCR的条件是不是时间短了，然后引物我觉得也有点短，如果引物的特异性不好的话，可以设计的长一些。
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2楼2010-09-16 11:16:11
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hongyuan1016

铁虫 (初入文坛)
试试巢式PCR
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3楼2010-09-16 11:19:14
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lijunping68

3'RACE问题

我3‘RACE PCR延伸时间是2min,测序结果在NCBI上Blast后没有和其相似的序列，和原来已扩出来的片段也拼接不上
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4楼2010-09-16 12:55:15
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
lijunping68(金币+1): 2010-09-16 20:50:21
lijunping68(金币+1): 2010-09-21 09:21:23
建议楼主重提RNA做反转录！
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jiayoubashaonian
5楼2010-09-16 13:37:57
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)
lijunping68(金币+1): 2010-09-17 15:06:44
lijunping68(金币+1): 2010-09-21 09:21:13
引用回帖:
Originally posted by lijunping68 at 2010-09-16 12:55:15:
我3‘RACE PCR延伸时间是2min,测序结果在NCBI上Blast后没有和其相似的序列，和原来已扩出来的片段也拼接不上

这个时间应该没问题。跟原来的序列接不上，blastX也不是类似功能的基因吗？那就是错配了，你说跟原来的序列对不上，那就说明是根据已经得到的序列设计的引物了哈，建议再好好选个地方重新设计引物。
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6楼2010-09-16 13:51:32
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jiaqing2

木虫 (著名写手)
用保真酶试试
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好好学习，天天向上
7楼2011-04-04 16:24:09
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-04-06 08:13:28
1,多轮巢式PCR
2重新做接头，可以试试B25
3cloneth盒子非常好
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8楼2011-04-04 22:17:13
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sai00fuji

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6): good 2011-04-06 08:13:46
我前天才开始做3‘race，可能没法给你什么建议，但是说说我的经历说不定能有点帮助。
最开始得到的是400bp的片段，去ncbi上blast，是我要的功能序列。所以准备做3’race。这里提一下，我blast的时候特别注意了一下我的片段是正义还是反义的，结果是反义链，所以我是按照互补序列设计的引物。
我提取的RNA质量不错，像广告图一样的。
然后p出的片段是900bp，应该说是合理的片段范围，现在还没测序，也不太清楚结果。
用的是takara的AMV反转录试剂盒
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9楼2011-04-05 22:37:25
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dayulee

木虫 (正式写手)

愚木虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换一种效果好的酶重新PCR试试
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好好学习，天天向上
10楼2012-05-21 22:59:06
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