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lijunping68

[交流] 【求助/交流】3'RACE问题

我做3'RACE做了两个多月了,可每次都出现弥散而且还有在700bp左右大小和1000bp左右大小有条带,不知道为什么会有弥散,回收酶切鉴定都正确,可是测序结果什么都不是,是什么原因呢?我想要的目的条带应该在1600bp左右,模板我鉴定过了,没什么问题,我设计的内外侧引物长度19bp和20bp,谢谢各位,帮帮我吧!

[ Last edited by lijunping68 on 2010-9-16 at 12:50 ]
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

lijunping68(金币+1): 2010-09-16 20:50:21
lijunping68(金币+1): 2010-09-21 09:21:23
建议楼主重提RNA做反转录!
jiayoubashaonian
5楼2010-09-16 13:37:57
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)

lijunping68(金币+1): 2010-09-16 12:49:05
lijunping68(金币+1): 2010-09-21 09:21:34
测序结果啥都不是是啥意思?不是你的目的基因吗?你的目的条带位置应该在1600左右,是加了3‘utr和PolyA之后的长度吗?如果不是的话,那么你的目的条带位置可能在2000左右呢。看看PCR的条件是不是时间短了,然后引物我觉得也有点短,如果引物的特异性不好的话,可以设计的长一些。
2楼2010-09-16 11:16:11
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lijunping68

3'RACE问题

我3‘RACE PCR延伸时间是2min,测序结果在NCBI上Blast后没有和其相似的序列,和原来已扩出来的片段也拼接不上
4楼2010-09-16 12:55:15
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)

lijunping68(金币+1): 2010-09-17 15:06:44
lijunping68(金币+1): 2010-09-21 09:21:13
引用回帖:
Originally posted by lijunping68 at 2010-09-16 12:55:15:
我3‘RACE PCR延伸时间是2min,测序结果在NCBI上Blast后没有和其相似的序列,和原来已扩出来的片段也拼接不上

这个时间应该没问题。跟原来的序列接不上,blastX也不是类似功能的基因吗?那就是错配了,你说跟原来的序列对不上,那就说明是根据已经得到的序列设计的引物了哈,建议再好好选个地方重新设计引物。
6楼2010-09-16 13:51:32
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