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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】小鼠单抗做WB的问题
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cheo163

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】小鼠单抗做WB的问题

我现在手上有一个需要鉴定的小鼠单抗，但是查资料显示这种蛋白只在鼠脑中表达，表达大小为25kd。但问题是我如果用鼠脑的组织样转膜做western，显色时鼠脑中的IgG轻重链也一起显示（大概55kd/25kd），就没办法确定我的鼠抗是不是阳性，不知道该怎么解决？


[ Last edited by cheo163 on 2010-9-3 at 16:30 ]
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1楼 2010-09-03 16:28:21
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cheo163

金虫 (小有名气)
自己顶~~！
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2楼2010-09-03 17:31:34
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cheo163

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2010-09-03 17:38:17:



什么叫鼠脑中的IgG的H和L chain也显示，鼠脑中有抗体么？你的表述是不是想说在你用鼠脑组织作WB的时候，为什么H和L chain也看得到？

对吧，就是这样，然后怎样才能不把那个H和L chain显色出来

[ Last edited by cheo163 on 2010-9-3 at 20:45 ]
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4楼2010-09-03 20:40:47
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cheo163

金虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2):鼓励一下！ 2010-09-03 21:54:54
而且小鼠还不是含有自身IgG，鼠脑中也有阿，制成组织lysis时，因为要煮，就把H和L chain分开了，加了抗鼠的二抗不就显色了~~
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5楼2010-09-03 20:58:38
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cheo163

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dianaofyezi at 2010-09-03 22:45:41:
我的印象是，不是所有的IgG能够通过血脑屏障。就像胎盘屏障一样。
所以你说的自身抗体是否能够进入鼠脑我有些怀疑。如果按照你说的他能够进入的话，是有可能在WB检测的时候检测到三条带。即H和L chain和目的带。 ...

因为现在我的wb图就是大概在55kd和25kd都有条带，但是我的目的带是25kd，就没办法区分，你说的用未标记的羊抗鼠二抗来做一个竞争性结合我已经安排下个礼拜做一下，但是不知道可不可行，到时候我会及时把结果汇报一下。现在就是很想把小鼠自身的IgG屏蔽掉，因为用Rat-brain做还只是有两条带，但是用mouse-brain做完全就是一团黑糊糊。
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7楼2010-09-03 23:01:11
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cheo163

金虫 (小有名气)
明天就可以出结果了~~
期待一下
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9楼2010-09-08 19:51:16
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cheo163

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lliu at 2010-09-04 11:13:06:




如果你的目的蛋白是25K，建议你用Anti-Fc 二抗。这样如果有交叉，也只会与H Chain （50K），而不会与L Chain反应（25K）反应。

这个方法不可行，实验结果显示rat-brain虽然屏蔽掉了rat-brain中25kd的L链，但我的目的带（actin 43kd）也没有了。
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10楼2010-09-09 09:14:31
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cheo163

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lliu at 2010-09-09 10:51:47:


你的目的蛋白不是25Kd吗？

如果你选用的单抗是IgG， 那么结果阴性只能说明你提取的蛋白中根本没有目的蛋白，或者二抗失效。没有理由可解释抗鼠Fc二抗不和鼠IgG反应。

另，你可以选用抗鼠K chain二抗试试 ...

当然，因为我不确定自己要检测的抗体是阴性还是阳性，所以我用actin抗体作对照，它的大小是43kd。二抗选用G抗M（Fc）
结果是：加原来二抗的有43的带，但加Fc二抗的是空白
......
那个二抗是从别人那里拿来的，我再去验证一下是否失效好了。

[ Last edited by cheo163 on 2010-9-9 at 13:43 ]
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12楼2010-09-09 13:37:45
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