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hgt832

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】细菌基因组DNA的提取法（CTAB/NaCl 法）,提取的DNA是否为细菌总DNA? 非� 已有10人参与

您好：

我需要提取革兰氏阳性菌的总DNA(包括染色体DNA和质粒DNA)。我在网上查到细菌基因组DNA的提取法（CTAB/NaCl 法）,请问这种方法提的是总DNA的吗？(包括染色体DNA和质粒DNA) （下面附有这种方法步骤）

细菌基因组DNA包括染色体DNA和质粒DNA吗？还是细菌基因组DNA只指染色体DNA？

我用这种方法提了DNA，用染色体DNA上的引物进行PCR,灵敏度很高，而用质粒DNA上的引物进行PCR，灵敏度却很低。开始我怀疑是引物的问题，用碱法专门提取了质粒的DNA,用质粒DNA上的引物进行PCR，灵敏度变得很高。说明不是引物的问题，而是细菌基因组DNA的提取法（CTAB/NaCl 法）的问题，这种方法提的质粒DNA浓度太低。我困惑的是网上有说这种方法是可以提细菌总DNA的(包括染色体DNA和质粒DNA)，但是我做的结果是这种方法提的质粒DNA浓度太低，根本满足不了实验要求。这种方法到底提的是总DNA的吗？还是提的是染色体DNA?

附 ：细菌基因组DNA的提取法（CTAB/NaCl 法）

1. 将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。
2. 取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3. 沉淀物加入567 ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.
4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。
5. 加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min, 将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。
6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

非常期待并感谢感谢您的回答！
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1楼 2010-07-14 12:05:06
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kobe8md1

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
质粒是超螺旋结构的，基因组是线性的，空间构象有差别。
你自己已经得出结论了，CTAB法提的是总DNA，主要是提线性的，质粒也能提一部分。
做什么实验2种DNA都要？  分开提不行吗？
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7楼2010-07-15 15:11:40
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skyqiuqiu119

木虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我感觉不是总DNA，有待考证。
赞一下(1人) 回复此楼
哎哟~可爱QQ~不错哦~~
2楼2010-07-14 12:12:09
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j2

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):正解~~~ 2010-07-14 23:18:15
革兰氏阳性菌该用溶菌酶作用1小时再按常规方法提吧
赞一下(2人) 回复此楼
修炼ｉｎｇ，当虫仙……
3楼2010-07-14 16:48:11
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hgt832

铜虫 (初入文坛)
是的，我在第一步加了溶菌酶了。我目的是提总DNA（包括染色体DNA和质粒DNA），请问这种方法是提总DNA的吗？为什么这种方法提取的质粒DNA浓度很低。有什么好的提总DNA的方法（提的质粒DNA浓度高些）吗？非常感谢！
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4楼2010-07-14 22:06:21
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