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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】基因缺失的方法
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】基因缺失的方法 已有8人参与

最近在做缺失，用的是同源重组的方法，要缺失的基因位于质粒上，尝试过同源臂的长度40bp、60bp，600bp，未果。坛子里的虫虫们还有其他好的方法没？
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
1楼 2010-07-05 11:00:11
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liouwzh

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-07-05 13:52:53
zhaohq1209(金币+1):谢谢建议哦 2010-07-05 19:48:13
做的是什么菌啊，如果是大肠杆菌或则一些类似的菌可以参考这篇文献One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products，非常方便，只能PCR引物中带有同源臂，在复制质粒的帮助下就可以敲除目的片段。
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2楼2010-07-05 12:53:12
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-07-05 13:53:01
zhaohq1209(金币+1):谢谢建议啊 2010-07-05 19:48:22
你可以把目的菌（需要敲除目的基因的菌）和含有已经敲除该基因的质粒的菌按一定比例混合在一块，点在板子上，过夜，然后稀释涂布，筛选!

当然了也可以用RNA干扰的方法！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2010-07-05 13:28:23
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xuezhen

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
学习学习一下！
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4楼2010-07-05 14:16:48
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rosalie161

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
同源臂有点短800以上吧，用高保真酶。
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Rosalei.....
5楼2010-07-05 17:37:05
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
amisking(金币+2):鼓励继续交流！ 2010-07-05 22:41:19
引用回帖:
Originally posted by liouwzh at 2010-07-05 12:53:12:
做的是什么菌啊，如果是大肠杆菌或则一些类似的菌可以参考这篇文献One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products，非常方便，只能PCR引物中带有同源臂，在复制质粒的 ...

谢谢建议。看了你推荐的这篇文献，用的是pKD46质粒，缺失的染色体上的基因，可是我要缺掉的基因是在质粒上，不知能否成功。
正在试此方法，呵呵~再次感谢
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
6楼2010-07-05 19:44:58
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2010-07-05 13:28:23:
你可以把目的菌（需要敲除目的基因的菌）和含有已经敲除该基因的质粒的菌按一定比例混合在一块，点在板子上，过夜，然后稀释涂布，筛选!

当然了也可以用RNA干扰的方法！

要做的就是敲出基因，也还没有拿到敲除基因的质粒，所以无法按照你推荐的方法来操作。如果以后的实验需要的话，也可以试试，呵呵~
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
7楼2010-07-05 19:46:20
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by rosalie161 at 2010-07-05 17:37:05:
同源臂有点短800以上吧，用高保真酶。

同源臂需要那么长么？我看文献上一般都是500~800bp左右。
另：为什么要高保真酶呢？
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
8楼2010-07-05 19:47:14
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zhaokaimrt

新虫 (小有名气)
路过路过
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9楼2010-07-05 20:16:47
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-05 19:47:14:

同源臂需要那么长么？我看文献上一般都是500~800bp左右。
另：为什么要高保真酶呢？

估计是要你保证序列的正确，你是不是可以考虑构建反向重复的载体？
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麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
10楼2010-07-08 20:52:45
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