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【求助/交流】请教酶活测定的问题已有2人参与
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| 各位前辈，请问有哪一位做过淀粉合成关键酶酶活的测定啊，那个标准曲线的底物是怎么做的呢 |
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biolio2009
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- 专业: 微生物生理与生物化学
2楼2010-06-26 16:04:08
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[4.3.5.1 AGPase的酶活测定 取20μL粗酶液加入110μL反应液中(反应液含终浓度100mmol•L-1Hepes-NaOH(pH=7.5)，1.2 mmol•L-1ADPG，3mmol•L-1PPi，5mmol•L-1MgCl2，4 mmol•L-1 DTT)，30℃反应20min，沸水中终止反应30s，10000×g，10min；取上清液100μL加5.2μL比色液(5.76mmol•L-1NADP，0.08unit P-guco-mutase，0.07unit G6P-dehydrogenase)，30℃反应10min，测定340nm OD值（Nakamura，1989)。 4.3.5.2 SSS和GBSS的酶活测定 取20μL粗酶液加入36μL反应液(反应液含终浓度为50mmol•L-1Hepes-NaOH(p H=7.5)，1.6mmol•L-1ADPG，0.7mg amylopectin，15mmol•L-1DTT)。30℃反应20min，沸水中终止反应30s，冰浴冷却；加20μL反应液(含50 mmol•L-1Hepes-NaOH(pH =7.5)， 4mmol•L-1PEP，200 mmol•L-1KCL，10mmol•L-1 MgCl2，1.2unit Pyruvate Kinase)，30℃反应20min，沸水中终止反应，10000×g离心10 min。取上清液60μL与43μL反应液(50mmol•L-1Hepes-NaOH(pH=7.5)，10mmol•L-1Glucose，20mmol•L-1 MgCl2，2 mmol•L-1NADP，1.4 unit Hexoki-nase，0.35unit G6P-dehydrogenase)，30℃反应10min，测定340nm OD值的变化。 GBSS活性的测定，取20μL 沉淀悬浮液，其余步骤同SSS酶活性的测定。 4.3.5.3 SBE的酶活测定 取酶液150μL，加150μL0.2 mol•L-1柠檬酸缓冲液(pH7.0)、75μL0.1 mol•L-1EDTA、40μL7.5g.L-1可溶性淀粉，在37℃水浴中加热40 min，再加24μL碘液显色10min，在660nm处测OD值，以零时为对照，Q 酶活性以OD 660nm下降的百分率表示: △OD660=(OD660零-OD660 t)/OD660零时×100%（李太贵等，1997)。 |
3楼2010-06-28 22:14:18