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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR问题
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】PCR问题已有8人参与

用引物做PCR扩增一核心片段，以前扩出来过，并且很特异，带很亮，回收了，转化没成功，重新扩，再也扩不出来了，怎么办？现在所有的试剂、反应条件都跟以前一摸一样，PCR后跑电泳却只有很长的拖带，请问是怎么回事？如何才能重新把那条带扩出来？ 期待高人指点!!!
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
1楼2010-06-17 09:36:24
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by j2 at 2010-06-17 11:18:04:
前段时间我也是不知道为什么就P不出来了，所有条件一样，后来重提了模板，降低了退火温度，又出来了，至今不知道是什么原因~

是不是与环境温度有关啊，我冬天和春天都扩的出来，一到夏天就扩不出来了，是不受温差影响很大？我降了退火温度扩不出来，升了也扩不出来。以前的退火温度是60度，是不设计引物时就不该选这么高退火温度的？好像说如果引物单上写的是60度，实际就得用65度，是这样吗？
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
5楼2010-06-17 15:32:05
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lmzxcom1 at 2010-06-17 16:05:23:
你的模板降解了， 用以前的PCR产物作为模板扩增，注意DNA要零下20度保存，不要反复冻容

新模板，扩b-actin扩的很好，就是扩目的基因扩不出来。可能是样品有问题，在这个季节是繁殖季节，可能这个基因关闭了
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
10楼2010-06-17 17:02:54
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 陈思容 at 2010-06-17 09:40:05:
提高退火温度

谢谢指点，我提高退火温度后有2管扩出来了，看我图片，7个温度梯度的，第一排的前2管扩出来了，500多bp的带
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
11楼2010-06-17 17:07:27
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阳光金鱼唐

金虫 (著名写手)
图片太大，传不上去。总之扩出点东西来了，不知道继续扩会怎样。。。。。。。。。。
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不知道什么是生活了，也不知道生活是什么了
13楼2010-06-17 17:15:05
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