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xuejinyz1

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[交流] 【求助/交流】RT-PCR总是得不到目的条带已有9人参与

我做RT-PCR已经很久了，最近电泳检测一直是呈弥散状，始终无法得到目的条带。RNA的提取个人认为已经是可以的了，三条带明显可见，略微有些拖带。然后按照TAKARA反转录试剂盒进行操作，内参条带很好，目的条带没有。

对反转录条件做调整后，在100-300bp处隐约可见条带，但我的条带(约900bp)处没有任何东西。我觉得是引物的可能性非常大，不过换了很多次的引物，结果还是一样。

希望得到大家的帮忙，解决这个让我心碎的问题，谢谢!

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1楼 2010-04-22 10:17:15

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shengwufenzi

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你是做的植物的吗？如果是的话，你应该考虑一下基因表达的时间性。有可能你现在选择的时间不是时候啊。

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2楼2010-04-23 22:36:10

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xuejinyz1

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RT-PCR总是得不到目的条带

我做得是动物组织的，也存在这个问题吗？

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3楼2010-04-24 16:54:03

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yujiaping1

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scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-26 17:08

引用回帖:

Originally posted by xuejinyz1 at 2010-04-24 16:54:03:
我做得是动物组织的，也存在这个问题吗？

动物组织当然也是存在这个问题的，不但要注意时间还要注意空间，就是说你的取样时间该基因可能不表达，你取的位置不对，可能也没有该基因的表达。这就是说，具体要看你做的是什么基因，在什么时候该基因表达，在什么组织中表达

按你说的情况，换了很多引物都效果不好，说明最大的可能就是跟基因丰度有关系
另外想知道楼主设计引物的模板，是就是该物种的该基因序列呢，还是近缘种设计的同源引物

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4楼2010-04-24 19:29:52

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xuejinyz1

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RT-PCR总是得不到目的条带

就是该物种的基因序列

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5楼2010-04-26 14:55:55

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yujiaping1

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plantaqp(金币+2): 2010-05-01 01:38

引用回帖:

Originally posted by xuejinyz1 at 2010-04-26 14:55:55:
就是该物种的基因序列

这么说，估计就是基因丰度太低的原因，还是考虑一下这种基因在什么情况下会表达，什么组织中表达的问题

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6楼2010-04-28 13:10:40

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jasco

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你是根据mRNA序列，cDNA序列还是基因组DNA序列设计引物的？注意内含子的影响

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7楼2010-04-28 17:07:26

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amilie030312

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引物不对的可能性最大，如果确认引物没问题那退火温度是否合适，不出条带的影响因素很多的。

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8楼2010-04-28 17:18:27

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目的基因在mRNA中的位置

我就按照genbank上mRNA基因序列来设计的引物，提供序列中的内含子已经去除了，所以不会影响的

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9楼2010-04-30 10:36:58

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xuejinyz1(金币+2): 2010-05-04 15:15:13

参考~估计是引物的问题额~

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迷惑不解~

10楼2010-04-30 23:35:36

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