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xuejinyz1

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】RT-PCR总是得不到目的条带 已有9人参与

我做RT-PCR已经很久了,最近电泳检测一直是呈弥散状,始终无法得到目的条带。RNA的提取个人认为已经是可以的了,三条带明显可见,略微有些拖带。然后按照TAKARA反转录试剂盒进行操作,内参条带很好,目的条带没有。

对反转录条件做调整后,在100-300bp处隐约可见条带,但我的条带(约900bp)处没有任何东西。我觉得是引物的可能性非常大,不过换了很多次的引物,结果还是一样。

希望得到大家的帮忙,解决这个让我心碎的问题,谢谢!
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amilie030312

金虫 (正式写手)

★ ★
plantaqp(金币+2): 2010-05-01 01:38
引物不对的可能性最大,如果确认引物没问题那退火温度是否合适,不出条带的影响因素很多的。
8楼2010-04-28 17:18:27
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shengwufenzi

金虫 (正式写手)

你是做的植物的吗?如果是的话,你应该考虑一下基因表达的时间性。有可能你现在选择的时间不是时候啊。
2楼2010-04-23 22:36:10
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xuejinyz1

铜虫 (初入文坛)

RT-PCR总是得不到目的条带

我做得是动物组织的,也存在这个问题吗?
3楼2010-04-24 16:54:03
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
scelab(金币+3):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-26 17:08
引用回帖:
Originally posted by xuejinyz1 at 2010-04-24 16:54:03:
我做得是动物组织的,也存在这个问题吗?

动物组织当然也是存在这个问题的,不但要注意时间还要注意空间,就是说你的取样时间该基因可能不表达,你取的位置不对,可能也没有该基因的表达。这就是说,具体要看你做的是什么基因,在什么时候该基因表达,在什么组织中表达

按你说的情况,换了很多引物都效果不好,说明最大的可能就是跟基因丰度有关系
另外想知道楼主设计引物的模板,是就是该物种的该基因序列呢,还是近缘种设计的同源引物
4楼2010-04-24 19:29:52
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