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runxiaoli

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于3'RACE的很奇怪的现象，求助大家乐

各位同仁：
       你们好。
      最近我在做3‘race。可是遇到的问题让我觉得很奇怪。
      我已经拿到了中间片段，设计了4个上游引物来进行pcr，都跑出带了，送出去测序，也都扩到了polyA，可是blast还不是我要的基因。我想问一下这是什么原因。是不是和我换了模板有关系，第一次做的时候，用的是SA处理后的模板，第二次用的则是NACL处理的，但是做中间片段的时候，跑出的带是一致的。
    很奇怪出现这个问题，不知道各位同仁有什么好的建议没有。
    希望大家给我出谋划策，不胜感激。
    祝大家快乐，身体健康，一切顺利。
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1楼2009-12-14 20:59:40
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)
★
runxiaoli(金币+1,VIP+0):非常感激。 12-15 19:49
补充一点点，做RACE的时候要注意扩增出来的片段大小，是不是和你预期的大小相似。UTR区域，大概加100个左右碱基吧。所以，你找到你的片段还有多长需要扩增，计算从引物到终止密码子的碱基数，加个50-100左右就是你应该得到的片段大小。如果得到了不同基因也要看看这个不是目的基因的基因是不是有用，毕竟得到一个新基因不容易，钱也花进去了，就要得到点结果的，多费点心思，不是坏事。在扩增中间片段的时候，即使得到的条带貌似一个单一条带，在链接到T载体后也要挑不同的克隆，用T载体通用引物做PCR看看，可能得到的条带会有点差别，这在克隆家族基因的isomer时有时会同时得到几个目的基因，这样的话，一下子得到好几个家族基因，对于后续实验质量，文章发表可以有质的提高。
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13楼2009-12-15 12:36:00
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
希望大家踊跃说出自己的意见，非常感激。
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2楼2009-12-14 21:16:28
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won7

金虫 (小有名气)
★
runxiaoli(金币+1,VIP+0): 12-15 08:32
你的带特异吗？你的polyA有前面有加尾信号（AATAAA）吗？你做BLAST时用测序的全长还是编码区？
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3楼2009-12-14 22:15:51
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)
★ ★
runxiaoli(金币+1,VIP+0): 12-15 08:39
runxiaoli(金币+1,VIP+0):非常感谢您的参与，欢迎多来指教。 12-15 08:39
中间片段的blast结果是你要的基因吗？设计了4个上游引物，每个引物单独做的3‘race吗？这4个PCR的产物都进行测序了吗？都不是你想要的片段？
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4楼2009-12-14 22:54:00
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by won7 at 2009-12-14 22:15:
你的带特异吗？你的polyA有前面有加尾信号（AATAAA）吗？你做BLAST时用测序的全长还是编码区？

当时我是搜了一段EST设计特异引物拿到的中间片段，该中间片段是编码区。用的是测序的全长，因为无法和中间片段拼接。谢谢你，你觉得会是什么原因。
polyA前面有加尾信号。
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5楼2009-12-15 08:35:01
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hugang2004_2000 at 2009-12-14 22:54:
中间片段的blast结果是你要的基因吗？设计了4个上游引物，每个引物单独做的3‘race吗？这4个PCR的产物都进行测序了吗？都不是你想要的片段？

我是做的半巢式pcr，如引物1，2，3，4，分别位于中间片段上游依次往下，最后是4号跑出带了，有两条，都送出去测序，都有polyA，都不是我要的片段。请问这最可能的原因是什么啊，不胜感激。
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6楼2009-12-15 08:39:07
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)
★
runxiaoli(金币+1,VIP+0):非常感谢 12-15 11:08
一个PCR产物为模板，跑了4次巢式？我觉得不太合适吧。最后只有4号引物有条带，而且还是两条，而且两条都不是你的片段，是不是说明你的引物特异性不够呢？不知道你的引物长度是多少，你可以在NCBI上把你的引物blast一下，看看特异性如何，是不是又你的目的基因。如果特异性足够的话，那就把引物弄长些试试，比如说30个碱基。你送去测序的是PCR产物吗？我觉得一个PCR条带里也有可能有不同的东西，最好弄到T载体里去测序吧。
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7楼2009-12-15 10:52:39
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wwyy0818

新虫 (小有名气)
★
runxiaoli(金币+1,VIP+0):非常感谢。 12-15 11:09
我在构建cDNA文库的时候，用第二链cDNA做模板特异性的筛选某些CDS，也会出现同样的问题，主要原因是引物特异性不强。建议：
既然已经拿到了中间序列，那么，请以该中间序列为下游引物，P出该CDS的起始区（起始密码子到你的中间序列这一段序列），然后再以该起始区为正向引物，即可P出全长
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8楼2009-12-15 11:07:21
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hugang2004_2000 at 2009-12-15 10:52:
一个PCR产物为模板，跑了4次巢式？我觉得不太合适吧。最后只有4号引物有条带，而且还是两条，而且两条都不是你的片段，是不是说明你的引物特异性不够呢？不知道你的引物长度是多少，你可以在NCBI上把你的引物blas ...

我的引物长度为19bp，我是克隆到T载体上进行测序的。引物BLAST，我还不太清楚如何验证，能不能帮忙发给我篇类似的文章。非常感激。
  我准备重新提取RNA，重新做模板，看看换模板之后测序如何。
  非常感谢您百忙之中对我的帮助，不胜感激。
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9楼2009-12-15 11:12:05
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wwyy0818 at 2009-12-15 11:07:
我在构建cDNA文库的时候，用第二链cDNA做模板特异性的筛选某些CDS，也会出现同样的问题，主要原因是引物特异性不强。建议：
既然已经拿到了中间序列，那么，请以该中间序列为下游引物，P出该CDS的起始区（起始密 ...

我扩出了5’,拿到了cds的起始区，我拿到的中间片段到起始区只有30个碱基，设计引物不合适，与扩3‘的下游引物出现错配，不过您的建议我会好好考虑，非常感谢。
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10楼2009-12-15 11:14:30
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