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runxiaoli木虫 (正式写手)
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[交流]
【求助/交流】关于3'RACE的很奇怪的现象，求助大家乐
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各位同仁： 你们好。 最近我在做3‘race。可是遇到的问题让我觉得很奇怪。 我已经拿到了中间片段，设计了4个上游引物来进行pcr，都跑出带了，送出去测序，也都扩到了polyA，可是blast还不是我要的基因。我想问一下这是什么原因。是不是和我换了模板有关系，第一次做的时候，用的是SA处理后的模板，第二次用的则是NACL处理的，但是做中间片段的时候，跑出的带是一致的。 很奇怪出现这个问题，不知道各位同仁有什么好的建议没有。 希望大家给我出谋划策，不胜感激。 祝大家快乐，身体健康，一切顺利。  |
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hugang2004_2000
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4楼2009-12-14 22:54:00
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7楼2009-12-15 10:52:39
hugang2004_2000
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runxiaoli(金币+2,VIP+0):非常感谢 12-15 11:40
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| 我觉得，既然你可以扩增出来其他基因的Poly A，而且你的中间片段也是从这个cDNA中扩增出来的，所以，你的cDNA应该是可以用的，没有必要再重新合成cDNA,毕竟试剂盒价格也是很可观的。19个碱基是可以进行pcr，但是在race里还是太短了，如果重新设计引物，增加引物长度，先设计两个引物就可以了，分别跟接头引物1，2做1st， 2edPCR，我觉得看那时候的结果如何吧，结果不好了也不用着急着和成新cDNA，再找找原因看。那个blast看特异性的方法很简单，把你的引物序列（每次一个）放到blastx就行了，看看检索出来的结果里有没有你要的基因，既然你扩增出来了其他基因，那么可能这些其他基因是在你的blastx结果里的。呵呵 |
11楼2009-12-15 11:23:09
hugang2004_2000
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runxiaoli(金币+1,VIP+0):非常感激。 12-15 19:49
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| 补充一点点，做RACE的时候要注意扩增出来的片段大小，是不是和你预期的大小相似。UTR区域，大概加100个左右碱基吧。所以，你找到你的片段还有多长需要扩增，计算从引物到终止密码子的碱基数，加个50-100左右就是你应该得到的片段大小。如果得到了不同基因也要看看这个不是目的基因的基因是不是有用，毕竟得到一个新基因不容易，钱也花进去了，就要得到点结果的，多费点心思，不是坏事。在扩增中间片段的时候，即使得到的条带貌似一个单一条带，在链接到T载体后也要挑不同的克隆，用T载体通用引物做PCR看看，可能得到的条带会有点差别，这在克隆家族基因的isomer时有时会同时得到几个目的基因，这样的话，一下子得到好几个家族基因，对于后续实验质量，文章发表可以有质的提高。 |
13楼2009-12-15 12:36:00
hugang2004_2000
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15楼2009-12-15 13:26:06