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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于3'RACE的很奇怪的现象，求助大家乐
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runxiaoli

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于3'RACE的很奇怪的现象，求助大家乐

各位同仁：
       你们好。
      最近我在做3‘race。可是遇到的问题让我觉得很奇怪。
      我已经拿到了中间片段，设计了4个上游引物来进行pcr，都跑出带了，送出去测序，也都扩到了polyA，可是blast还不是我要的基因。我想问一下这是什么原因。是不是和我换了模板有关系，第一次做的时候，用的是SA处理后的模板，第二次用的则是NACL处理的，但是做中间片段的时候，跑出的带是一致的。
    很奇怪出现这个问题，不知道各位同仁有什么好的建议没有。
    希望大家给我出谋划策，不胜感激。
    祝大家快乐，身体健康，一切顺利。
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1楼2009-12-14 20:59:40
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
希望大家踊跃说出自己的意见，非常感激。
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2楼2009-12-14 21:16:28
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
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Originally posted by won7 at 2009-12-14 22:15:
你的带特异吗？你的polyA有前面有加尾信号（AATAAA）吗？你做BLAST时用测序的全长还是编码区？

当时我是搜了一段EST设计特异引物拿到的中间片段，该中间片段是编码区。用的是测序的全长，因为无法和中间片段拼接。谢谢你，你觉得会是什么原因。
polyA前面有加尾信号。
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5楼2009-12-15 08:35:01
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
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Originally posted by hugang2004_2000 at 2009-12-14 22:54:
中间片段的blast结果是你要的基因吗？设计了4个上游引物，每个引物单独做的3‘race吗？这4个PCR的产物都进行测序了吗？都不是你想要的片段？

我是做的半巢式pcr，如引物1，2，3，4，分别位于中间片段上游依次往下，最后是4号跑出带了，有两条，都送出去测序，都有polyA，都不是我要的片段。请问这最可能的原因是什么啊，不胜感激。
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6楼2009-12-15 08:39:07
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hugang2004_2000 at 2009-12-15 10:52:
一个PCR产物为模板，跑了4次巢式？我觉得不太合适吧。最后只有4号引物有条带，而且还是两条，而且两条都不是你的片段，是不是说明你的引物特异性不够呢？不知道你的引物长度是多少，你可以在NCBI上把你的引物blas ...

我的引物长度为19bp，我是克隆到T载体上进行测序的。引物BLAST，我还不太清楚如何验证，能不能帮忙发给我篇类似的文章。非常感激。
  我准备重新提取RNA，重新做模板，看看换模板之后测序如何。
  非常感谢您百忙之中对我的帮助，不胜感激。
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9楼2009-12-15 11:12:05
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
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Originally posted by wwyy0818 at 2009-12-15 11:07:
我在构建cDNA文库的时候，用第二链cDNA做模板特异性的筛选某些CDS，也会出现同样的问题，主要原因是引物特异性不强。建议：
既然已经拿到了中间序列，那么，请以该中间序列为下游引物，P出该CDS的起始区（起始密 ...

我扩出了5’,拿到了cds的起始区，我拿到的中间片段到起始区只有30个碱基，设计引物不合适，与扩3‘的下游引物出现错配，不过您的建议我会好好考虑，非常感谢。
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10楼2009-12-15 11:14:30
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hugang2004_2000 at 2009-12-15 11:23:
我觉得，既然你可以扩增出来其他基因的Poly A，而且你的中间片段也是从这个cDNA中扩增出来的，所以，你的cDNA应该是可以用的，没有必要再重新合成cDNA,毕竟试剂盒价格也是很可观的。19个碱基是可以进行pcr，但是在 ...

嗯，我会好好做的！谢谢您，有问题再向您请教，非常感激。
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12楼2009-12-15 11:41:16
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runxiaoli

木虫 (正式写手)
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Originally posted by liyong1981 at 2009-12-15 13:02:
你们知不知道有个名词叫基因家族，还有个加同源序列。
建议：重新设计引物，你运气不好，第一次设计的引物正好中奖了

我设计了2次引物了，第一次得到的是另外一个基因家族的。第二次则是预测蛋白和其他不知道什么的基因。谢谢您的提醒，我会好好做的！
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16楼2009-12-15 19:51:00
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