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runxiaoli

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于3'RACE的很奇怪的现象,求助大家乐

各位同仁:
       你们好。
      最近我在做3‘race。可是遇到的问题让我觉得很奇怪。
      我已经拿到了中间片段,设计了4个上游引物来进行pcr,都跑出带了,送出去测序,也都扩到了polyA,可是blast还不是我要的基因。我想问一下这是什么原因。是不是和我换了模板有关系,第一次做的时候,用的是SA处理后的模板,第二次用的则是NACL处理的,但是做中间片段的时候,跑出的带是一致的。
    很奇怪出现这个问题,不知道各位同仁有什么好的建议没有。
    希望大家给我出谋划策,不胜感激。
    祝大家快乐,身体健康,一切顺利。
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)


runxiaoli(金币+1,VIP+0):非常感谢 12-15 11:08
一个PCR产物为模板,跑了4次巢式?我觉得不太合适吧。最后只有4号引物有条带,而且还是两条,而且两条都不是你的片段,是不是说明你的引物特异性不够呢?不知道你的引物长度是多少,你可以在NCBI上把你的引物blast一下,看看特异性如何,是不是又你的目的基因。如果特异性足够的话,那就把引物弄长些试试,比如说30个碱基。你送去测序的是PCR产物吗?我觉得一个PCR条带里也有可能有不同的东西,最好弄到T载体里去测序吧。
7楼2009-12-15 10:52:39
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runxiaoli

木虫 (正式写手)

希望大家踊跃说出自己的意见,非常感激。
2楼2009-12-14 21:16:28
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won7

金虫 (小有名气)


runxiaoli(金币+1,VIP+0): 12-15 08:32
你的带特异吗?你的polyA有前面有加尾信号(AATAAA)吗?你做BLAST时用测序的全长还是编码区?
3楼2009-12-14 22:15:51
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)

★ ★
runxiaoli(金币+1,VIP+0): 12-15 08:39
runxiaoli(金币+1,VIP+0):非常感谢您的参与,欢迎多来指教。 12-15 08:39
中间片段的blast结果是你要的基因吗?设计了4个上游引物,每个引物单独做的3‘race吗?这4个PCR的产物都进行测序了吗?都不是你想要的片段?
4楼2009-12-14 22:54:00
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