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runxiaoli

木虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】关于3'RACE的很奇怪的现象，求助大家乐

各位同仁：
   你们好。
   最近我在做3‘race。可是遇到的问题让我觉得很奇怪。
   我已经拿到了中间片段，设计了4个上游引物来进行pcr，都跑出带了，送出去测序，也都扩到了polyA，可是blast还不是我要的基因。我想问一下这是什么原因。是不是和我换了模板有关系，第一次做的时候，用的是SA处理后的模板，第二次用的则是NACL处理的，但是做中间片段的时候，跑出的带是一致的。
很奇怪出现这个问题，不知道各位同仁有什么好的建议没有。
希望大家给我出谋划策，不胜感激。
祝大家快乐，身体健康，一切顺利。

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1楼2009-12-14 20:59:40

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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)

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runxiaoli(金币+2,VIP+0):非常感谢 12-15 11:40
runxiaoli(金币+1,VIP+0): 12-15 11:40

我觉得，既然你可以扩增出来其他基因的Poly A，而且你的中间片段也是从这个cDNA中扩增出来的，所以，你的cDNA应该是可以用的，没有必要再重新合成cDNA,毕竟试剂盒价格也是很可观的。19个碱基是可以进行pcr，但是在race里还是太短了，如果重新设计引物，增加引物长度，先设计两个引物就可以了，分别跟接头引物1，2做1st， 2edPCR，我觉得看那时候的结果如何吧，结果不好了也不用着急着和成新cDNA，再找找原因看。那个blast看特异性的方法很简单，把你的引物序列（每次一个）放到blastx就行了，看看检索出来的结果里有没有你要的基因，既然你扩增出来了其他基因，那么可能这些其他基因是在你的blastx结果里的。呵呵