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runxiaoli

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[交流] 【求助/交流】关于3'RACE的很奇怪的现象，求助大家乐

各位同仁：
   你们好。
   最近我在做3‘race。可是遇到的问题让我觉得很奇怪。
   我已经拿到了中间片段，设计了4个上游引物来进行pcr，都跑出带了，送出去测序，也都扩到了polyA，可是blast还不是我要的基因。我想问一下这是什么原因。是不是和我换了模板有关系，第一次做的时候，用的是SA处理后的模板，第二次用的则是NACL处理的，但是做中间片段的时候，跑出的带是一致的。
很奇怪出现这个问题，不知道各位同仁有什么好的建议没有。
希望大家给我出谋划策，不胜感激。
祝大家快乐，身体健康，一切顺利。

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1楼2009-12-14 20:59:40

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runxiaoli

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引用回帖:

Originally posted by wwyy0818 at 2009-12-15 11:07:
我在构建cDNA文库的时候，用第二链cDNA做模板特异性的筛选某些CDS，也会出现同样的问题，主要原因是引物特异性不强。建议：
既然已经拿到了中间序列，那么，请以该中间序列为下游引物，P出该CDS的起始区（起始密 ...

我扩出了5’,拿到了cds的起始区，我拿到的中间片段到起始区只有30个碱基，设计引物不合适，与扩3‘的下游引物出现错配，不过您的建议我会好好考虑，非常感谢。