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runxiaoli

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[交流] 【求助/交流】关于3'RACE的很奇怪的现象，求助大家乐

各位同仁：
   你们好。
   最近我在做3‘race。可是遇到的问题让我觉得很奇怪。
   我已经拿到了中间片段，设计了4个上游引物来进行pcr，都跑出带了，送出去测序，也都扩到了polyA，可是blast还不是我要的基因。我想问一下这是什么原因。是不是和我换了模板有关系，第一次做的时候，用的是SA处理后的模板，第二次用的则是NACL处理的，但是做中间片段的时候，跑出的带是一致的。
很奇怪出现这个问题，不知道各位同仁有什么好的建议没有。
希望大家给我出谋划策，不胜感激。
祝大家快乐，身体健康，一切顺利。

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1楼2009-12-14 20:59:40

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runxiaoli

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引用回帖:

Originally posted by hugang2004_2000 at 2009-12-15 10:52:
一个PCR产物为模板，跑了4次巢式？我觉得不太合适吧。最后只有4号引物有条带，而且还是两条，而且两条都不是你的片段，是不是说明你的引物特异性不够呢？不知道你的引物长度是多少，你可以在NCBI上把你的引物blas ...

我的引物长度为19bp，我是克隆到T载体上进行测序的。引物BLAST，我还不太清楚如何验证，能不能帮忙发给我篇类似的文章。非常感激。
我准备重新提取RNA，重新做模板，看看换模板之后测序如何。
非常感谢您百忙之中对我的帮助，不胜感激。