应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切连接问题
131/2返回列表12下一页
查看: 1168  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

漫迹

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切连接问题

大虾们，我最近用双酶切的方法对目的片段和质粒进行连接，
步骤是：先对两者进行双酶切，切胶回收，回收后电泳条带亮度差不多，位置正确，有点暗，但是肉眼可见，试了1：5，1：7，1：9，不同比例进行连接，化转后平板上都没有目的转化子，反而有杂菌菌落，很是郁闷，帮我分析下原因吧，先谢谢了哦
补充;我连接用的是宝生物的Soulution1,时间为20个小时左右
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2009-12-06 16:15:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-6 17:04
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-6 17:40
为何会有杂菌……最坏情况就是不长
电泳出来的条带明暗反映的是质量，而不是摩尔数
记得换算
是不是没有切动~~质粒好切，但是PCR产物的话，引物要设计好保护碱基，不然效率很低
赞一下(21人) 回复此楼
2楼2009-12-06 16:21:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

漫迹

金虫 (小有名气)
“为何会有杂菌……最坏情况就是不长
电泳出来的条带明暗反映的是质量，而不是摩尔数
记得换算
是不是没有切动~~质粒好切，但是PCR产物的话，引物要设计好保护碱基，不然     效率很低”

我酶切回收后电泳不是能看看浓度比么
目的片段P完我先连在T载体上了，也测序鉴定了，没有问题，酶切电泳后大小也是对的呢
赞一下 回复此楼
3楼2009-12-06 16:48:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 12-6 17:05
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-6 17:40
有杂菌菌落，没加抗生素，还是抗生素失效了，还是平板长的时间太长？
建议做个对照，转空载体，看看感受态是否有问题。
如果不是感受态的问题，问题就出在连接上了。
赞一下(21人) 回复此楼
Thank-you，so-blue.
4楼2009-12-06 17:02:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

漫迹

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-12-6 17:02:
有杂菌菌落，没加抗生素，还是抗生素失效了，还是平板长的时间太长？
建议做个对照，转空载体，看看感受态是否有问题。
如果不是感受态的问题，问题就出在连接上了。

加了抗生素了，我转到大肠里，挑了菌落，都是球状的，我对感受态做过镜检，没问题的，问题应该出在连接上，可是又分析不出为什么连接不上
赞一下 回复此楼
5楼2009-12-06 17:39:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tianpingpe

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-7 10:47
amisking(金币+2,VIP+0): 12-7 11:52
你电泳后是用什么染色的呢，如果是eb的话，有可能会降低你连接效率，最好是无eb回收，有段时间我们也是连接转化有问题，后来发现是EB量太高，影响了连接效率，还有一点是sollution i连接效率本来就比较低，需要加入的buffer太多，里面的连接产物和载体太少，最好是用t4 连接酶。载体和片段的比例是摩尔比，不是质量比。再检查一下你的酶切位点，有的时候如果没有太注意位点，比较也许基因里面有个位点，但是没有发现，但是酶切的时候切掉了，但是比较小，电泳有的时候是看不出来的，再检查下你的酶切位点。感受态你最好转化个质粒，估计下转化率。
赞一下(20人) 回复此楼
6楼2009-12-06 22:40:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang
都是高手啊，学习了，谢谢！
赞一下 回复此楼
每天进步一点点，持之以恒！
7楼2009-12-07 10:39:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

漫迹

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by tianpingpe at 2009-12-6 22:40:
你电泳后是用什么染色的呢，如果是eb的话，有可能会降低你连接效率，最好是无eb回收，有段时间我们也是连接转化有问题，后来发现是EB量太高，影响了连接效率，还有一点是sollution i连接效率本来就比较低，需要加 ...

我用的就是EB染色，可能有这方面的原因，不过我的连接酶用的是TAKALA的Solution1，不用加任何buffer的，我再确认下酶切问点吧，谢谢了哦
赞一下 回复此楼
8楼2009-12-07 10:54:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

changes

木虫 (正式写手)
★
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-8 16:18
可能是载体没切好，分步酶切试试。沉淀回收也可。
赞一下 回复此楼
9楼2009-12-07 11:48:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cavafory

铁虫 (小有名气)

我最近也是做单克隆出不来

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-7 20:26
我最近也是做单克隆出不来，郁闷死了，pcr后的片段和载体都分别切了四个小时，连接后看到板子上长出来了，可是酶切发现都没有目的带，郁闷死了，到底是哪里错了呢
赞一下(20人) 回复此楼
10楼2009-12-07 20:25:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 漫迹 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 305求调剂 +6 77Qi 2026-04-07 6/300 2026-04-12 02:30 by 秋豆菜芽
[考研] 280求调剂 +7 兮兮夜夜 2026-04-09 10/500 2026-04-12 00:33 by 蓝云思雨
[考研] 求调剂 +11 月@163.com 2026-04-07 13/650 2026-04-11 22:55 by BruceLiu320
[考研] 343求调剂 +9 王国帅 2026-04-10 9/450 2026-04-11 20:31 by dongdian1
[考研] 281求调剂 +11 觉得好的吧 2026-04-10 11/550 2026-04-11 09:35 by 逆水乘风
[材料工程] 材料调剂推荐 +8 蛋糕x2 2026-04-07 8/400 2026-04-10 23:13 by Ftglcn90
[考研] 中科院总分315求调剂 +8 lallalh 2026-04-09 8/400 2026-04-10 19:30 by dick_runner
[论文投稿] mdpi小修rvr时间四五天了 20+3 哈哈high 2026-04-08 5/250 2026-04-10 16:02 by 北京莱茵润色
[考研] 08600生物与医药-327 +10 18755400796 2026-04-05 10/500 2026-04-10 08:14 by kangsm
[考研] 材料专硕初试分332一志愿西北工业大学， +12 故人?? 2026-04-09 12/600 2026-04-09 18:34 by Ccclqqq
[考研] 一志愿中科院105500专业总分315求调剂 +6 lallalh 2026-04-09 7/350 2026-04-09 17:51 by lallalh
[考研] 332，085601求调剂 +12 ydfyh 2026-04-09 14/700 2026-04-09 17:28 by wp06
[考研] 一志愿武理车辆 281 求调剂 +5 上岸研究生. 2026-04-07 5/250 2026-04-09 15:56 by only周
[考研] 322求调剂，08工科 +3 今天是个小号 2026-04-08 3/150 2026-04-09 15:53 by wp06
[考研] 一志愿西南大学生物学学硕344 求生物学相关调剂/生物与医药 +7 超人不会飞@ 2026-04-08 7/350 2026-04-09 09:35 by gong120082
[考研] 316求调剂 +4 15318418673 2026-04-07 4/200 2026-04-07 22:12 by hemengdong
[考研] 305求调剂 +4 77Qi 2026-04-06 4/200 2026-04-07 20:06 by shanqishi
[考研] 一志愿西电085401求调剂 +4 sunw1306 2026-04-07 4/200 2026-04-07 16:40 by 啵啵啵0119
[考研] 22408 318分求调剂 +4 勤奋的小笼包 2026-04-06 6/300 2026-04-07 15:05 by 纸鹤555
[考研] 081200-11408-367学硕求调剂 +4 1_2_3111 2026-04-06 4/200 2026-04-07 08:13 by jp9609
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭