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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切连接问题
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漫迹

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切连接问题

大虾们，我最近用双酶切的方法对目的片段和质粒进行连接，
步骤是：先对两者进行双酶切，切胶回收，回收后电泳条带亮度差不多，位置正确，有点暗，但是肉眼可见，试了1：5，1：7，1：9，不同比例进行连接，化转后平板上都没有目的转化子，反而有杂菌菌落，很是郁闷，帮我分析下原因吧，先谢谢了哦
补充;我连接用的是宝生物的Soulution1,时间为20个小时左右
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1楼 2009-12-06 16:15:05
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-6 17:04
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-6 17:40
为何会有杂菌……最坏情况就是不长
电泳出来的条带明暗反映的是质量，而不是摩尔数
记得换算
是不是没有切动~~质粒好切，但是PCR产物的话，引物要设计好保护碱基，不然效率很低
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2楼2009-12-06 16:21:58
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漫迹

金虫 (小有名气)
“为何会有杂菌……最坏情况就是不长
电泳出来的条带明暗反映的是质量，而不是摩尔数
记得换算
是不是没有切动~~质粒好切，但是PCR产物的话，引物要设计好保护碱基，不然     效率很低”

我酶切回收后电泳不是能看看浓度比么
目的片段P完我先连在T载体上了，也测序鉴定了，没有问题，酶切电泳后大小也是对的呢
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3楼2009-12-06 16:48:23
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 12-6 17:05
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-6 17:40
有杂菌菌落，没加抗生素，还是抗生素失效了，还是平板长的时间太长？
建议做个对照，转空载体，看看感受态是否有问题。
如果不是感受态的问题，问题就出在连接上了。
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Thank-you，so-blue.
4楼2009-12-06 17:02:21
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漫迹

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2009-12-6 17:02:
有杂菌菌落，没加抗生素，还是抗生素失效了，还是平板长的时间太长？
建议做个对照，转空载体，看看感受态是否有问题。
如果不是感受态的问题，问题就出在连接上了。

加了抗生素了，我转到大肠里，挑了菌落，都是球状的，我对感受态做过镜检，没问题的，问题应该出在连接上，可是又分析不出为什么连接不上
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5楼2009-12-06 17:39:00
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tianpingpe

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-7 10:47
amisking(金币+2,VIP+0): 12-7 11:52
你电泳后是用什么染色的呢，如果是eb的话，有可能会降低你连接效率，最好是无eb回收，有段时间我们也是连接转化有问题，后来发现是EB量太高，影响了连接效率，还有一点是sollution i连接效率本来就比较低，需要加入的buffer太多，里面的连接产物和载体太少，最好是用t4 连接酶。载体和片段的比例是摩尔比，不是质量比。再检查一下你的酶切位点，有的时候如果没有太注意位点，比较也许基因里面有个位点，但是没有发现，但是酶切的时候切掉了，但是比较小，电泳有的时候是看不出来的，再检查下你的酶切位点。感受态你最好转化个质粒，估计下转化率。
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6楼2009-12-06 22:40:59
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张晓梅ZXM

金虫 (正式写手)

meimeizhang
都是高手啊，学习了，谢谢！
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每天进步一点点，持之以恒！
7楼2009-12-07 10:39:21
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漫迹

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by tianpingpe at 2009-12-6 22:40:
你电泳后是用什么染色的呢，如果是eb的话，有可能会降低你连接效率，最好是无eb回收，有段时间我们也是连接转化有问题，后来发现是EB量太高，影响了连接效率，还有一点是sollution i连接效率本来就比较低，需要加 ...

我用的就是EB染色，可能有这方面的原因，不过我的连接酶用的是TAKALA的Solution1，不用加任何buffer的，我再确认下酶切问点吧，谢谢了哦
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8楼2009-12-07 10:54:49
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changes

木虫 (正式写手)
★
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-8 16:18
可能是载体没切好，分步酶切试试。沉淀回收也可。
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9楼2009-12-07 11:48:09
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cavafory

铁虫 (小有名气)

我最近也是做单克隆出不来

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-7 20:26
我最近也是做单克隆出不来，郁闷死了，pcr后的片段和载体都分别切了四个小时，连接后看到板子上长出来了，可是酶切发现都没有目的带，郁闷死了，到底是哪里错了呢
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10楼2009-12-07 20:25:42
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