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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切连接问题
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漫迹

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切连接问题

大虾们，我最近用双酶切的方法对目的片段和质粒进行连接，
步骤是：先对两者进行双酶切，切胶回收，回收后电泳条带亮度差不多，位置正确，有点暗，但是肉眼可见，试了1：5，1：7，1：9，不同比例进行连接，化转后平板上都没有目的转化子，反而有杂菌菌落，很是郁闷，帮我分析下原因吧，先谢谢了哦
补充;我连接用的是宝生物的Soulution1,时间为20个小时左右
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1楼 2009-12-06 16:15:05
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cavafory

铁虫 (小有名气)

我最近也是做单克隆出不来

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-7 20:26
我最近也是做单克隆出不来，郁闷死了，pcr后的片段和载体都分别切了四个小时，连接后看到板子上长出来了，可是酶切发现都没有目的带，郁闷死了，到底是哪里错了呢
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10楼2009-12-07 20:25:42
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查看全部 13 个回答

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-6 17:04
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-6 17:40
为何会有杂菌……最坏情况就是不长
电泳出来的条带明暗反映的是质量，而不是摩尔数
记得换算
是不是没有切动~~质粒好切，但是PCR产物的话，引物要设计好保护碱基，不然效率很低
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2楼2009-12-06 16:21:58
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漫迹

金虫 (小有名气)
“为何会有杂菌……最坏情况就是不长
电泳出来的条带明暗反映的是质量，而不是摩尔数
记得换算
是不是没有切动~~质粒好切，但是PCR产物的话，引物要设计好保护碱基，不然     效率很低”

我酶切回收后电泳不是能看看浓度比么
目的片段P完我先连在T载体上了，也测序鉴定了，没有问题，酶切电泳后大小也是对的呢
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3楼2009-12-06 16:48:23
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 12-6 17:05
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-6 17:40
有杂菌菌落，没加抗生素，还是抗生素失效了，还是平板长的时间太长？
建议做个对照，转空载体，看看感受态是否有问题。
如果不是感受态的问题，问题就出在连接上了。
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Thank-you，so-blue.
4楼2009-12-06 17:02:21
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查看全部 13 个回答
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