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漫迹

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切连接问题

大虾们,我最近用双酶切的方法对目的片段和质粒进行连接,
步骤是:先对两者进行双酶切,切胶回收,回收后电泳条带亮度差不多,位置正确,有点暗,但是肉眼可见,试了1:5,1:7,1:9,不同比例进行连接,化转后平板上都没有目的转化子,反而有杂菌菌落,很是郁闷,帮我分析下原因吧,先谢谢了哦
补充;我连接用的是宝生物的Soulution1,时间为20个小时左右
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cavafory

铁虫 (小有名气)

我最近也是做单克隆出不来

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-7 20:26
我最近也是做单克隆出不来,郁闷死了,pcr后的片段和载体都分别切了四个小时,连接后看到板子上长出来了,可是酶切发现都没有目的带,郁闷死了,到底是哪里错了呢
10楼2009-12-07 20:25:42
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cavafory

铁虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
双酶切以后不能用沉淀的方法回收,因为里面有你要的也有你不要的片段啊,先做凝胶电泳,注意浓度,然后用试剂盒回收,回收效率没有试剂盒上面说的那么高,所以你做酶切的时候体系大点多切点质粒。如果你没有试剂盒最好用低熔点的琼脂糖,利于后面的连接实验
13楼2009-12-30 11:31:46
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