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[交流]
【求助/交流】双酶切连接问题
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大虾们，我最近用双酶切的方法对目的片段和质粒进行连接， 步骤是：先对两者进行双酶切，切胶回收，回收后电泳条带亮度差不多，位置正确，有点暗，但是肉眼可见，试了1：5，1：7，1：9，不同比例进行连接，化转后平板上都没有目的转化子，反而有杂菌菌落，很是郁闷，帮我分析下原因吧，先谢谢了哦 补充;我连接用的是宝生物的Soulution1,时间为20个小时左右 |
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2楼2009-12-06 16:21:58
3楼2009-12-06 16:48:23
susizheng
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4楼2009-12-06 17:02:21
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amisking(金币+2,VIP+0): 12-7 11:52
| 你电泳后是用什么染色的呢，如果是eb的话，有可能会降低你连接效率，最好是无eb回收，有段时间我们也是连接转化有问题，后来发现是EB量太高，影响了连接效率，还有一点是sollution i连接效率本来就比较低，需要加入的buffer太多，里面的连接产物和载体太少，最好是用t4 连接酶。载体和片段的比例是摩尔比，不是质量比。再检查一下你的酶切位点，有的时候如果没有太注意位点，比较也许基因里面有个位点，但是没有发现，但是酶切的时候切掉了，但是比较小，电泳有的时候是看不出来的，再检查下你的酶切位点。感受态你最好转化个质粒，估计下转化率。 |
6楼2009-12-06 22:40:59
张晓梅ZXM
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