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漫迹

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】双酶切连接问题

大虾们,我最近用双酶切的方法对目的片段和质粒进行连接,
步骤是:先对两者进行双酶切,切胶回收,回收后电泳条带亮度差不多,位置正确,有点暗,但是肉眼可见,试了1:5,1:7,1:9,不同比例进行连接,化转后平板上都没有目的转化子,反而有杂菌菌落,很是郁闷,帮我分析下原因吧,先谢谢了哦
补充;我连接用的是宝生物的Soulution1,时间为20个小时左右
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漫迹

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by tianpingpe at 2009-12-6 22:40:
你电泳后是用什么染色的呢,如果是eb的话,有可能会降低你连接效率,最好是无eb回收,有段时间我们也是连接转化有问题,后来发现是EB量太高,影响了连接效率,还有一点是sollution i连接效率本来就比较低,需要加 ...

我用的就是EB染色,可能有这方面的原因,不过我的连接酶用的是TAKALA的Solution1,不用加任何buffer的,我再确认下酶切问点吧,谢谢了哦
8楼2009-12-07 10:54:49
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★
amisking(金币+2,VIP+0): 12-6 17:04
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-6 17:40
为何会有杂菌……最坏情况就是不长
电泳出来的条带明暗反映的是质量,而不是摩尔数
记得换算
是不是没有切动~~质粒好切,但是PCR产物的话,引物要设计好保护碱基,不然效率很低
2楼2009-12-06 16:21:58
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漫迹

金虫 (小有名气)

“为何会有杂菌……最坏情况就是不长
电泳出来的条带明暗反映的是质量,而不是摩尔数
记得换算
是不是没有切动~~质粒好切,但是PCR产物的话,引物要设计好保护碱基,不然     效率很低”

我酶切回收后电泳不是能看看浓度比么
目的片段P完我先连在T载体上了,也测序鉴定了,没有问题,酶切电泳后大小也是对的呢
3楼2009-12-06 16:48:23
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

★ ★ ★ ★
amisking(金币+3,VIP+0): 12-6 17:05
漫迹(金币+1,VIP+0): 12-6 17:40
有杂菌菌落,没加抗生素,还是抗生素失效了,还是平板长的时间太长?
建议做个对照,转空载体,看看感受态是否有问题。
如果不是感受态的问题,问题就出在连接上了。
Thank-you,so-blue.
4楼2009-12-06 17:02:21
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