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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 克隆基因为什么一直克隆不出来
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18388248062

新虫 (初入文坛)

[求助] 克隆基因为什么一直克隆不出来 已有5人参与

设计引物，以cDNA为模板，pcr跑了无数次，退火温度换了无数次，为什么就是克隆不出来，即使重新设计引物，或者分段设计引物，前半段好不容易出现条带，去测序，可又什么也不是，好心累，求各位大神指导下

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1楼 2017-06-19 16:08:50
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hx814102

新虫 (正式写手)
肯定模板或引物有一个出了问题

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Everydayisanewday!
2楼2017-06-19 18:18:46
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薄荷颜料

新虫 (初入文坛)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-06-20 23:09:52
1，表达部位
你的cdna取的是什么材料什么部位的？或许你要的基因在这个部位根本不表达？换个部位试试？
2，用基因组做pcr扩基因
如果是过表达，那最后转录翻译都是一样的，如果是看定位什么的，就有差异了
3，换个模板
问师兄师姐师弟师妹还有其他实验室的战友们借一个吧，或者换个人给你p一下，全部用他的试剂
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4楼2017-06-20 21:45:45
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普通回帖

hhz09423

金虫 (正式写手)
不行换个酶试试

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3楼2017-06-19 19:52:54
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往阳光多处走

新虫 (小有名气)
你克的是什么？需不需要前期诱导再去提RNA？

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5楼2017-06-21 07:56:27
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stabilized

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你加个阳性对照，看看是不是cDNA不行
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坚持！
6楼2017-06-21 08:44:46
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18388248062

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hx814102 at 2017-06-19 18:18:46
肯定模板或引物有一个出了问题

模板没问题呢

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7楼2017-06-21 17:21:47
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新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 往阳光多处走 at 2017-06-21 07:56:27
你克的是什么？需不需要前期诱导再去提RNA？

合成葡甘聚糖基因CSLA3

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8楼2017-06-21 17:22:31
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18388248062

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 薄荷颜料 at 2017-06-20 21:45:45
1，表达部位
你的cdna取的是什么材料什么部位的？或许你要的基因在这个部位根本不表达？换个部位试试？
2，用基因组做pcr扩基因
如果是过表达，那最后转录翻译都是一样的，如果是看定位什么的，就有差异了
3，换 ...

我的那个基因只有在球茎才会有，其他部位没有，我去NCBI上找，找不到基因组，而且我那个基因只有目的片段，ATG…TAG。不像其他基因那样两端有多余的片段，可以设计引物，我这个我导师直接拿两尾做引物，硬是做不出来。心累

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9楼2017-06-21 17:32:04
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新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by stabilized at 2017-06-21 08:44:46
你加个阳性对照，看看是不是cDNA不行

做过了，可以用

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10楼2017-06-21 17:32:48
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