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新虫 (初入文坛)

[求助] 克隆基因为什么一直克隆不出来 已有5人参与

设计引物,以cDNA为模板,pcr跑了无数次,退火温度换了无数次,为什么就是克隆不出来,即使重新设计引物,或者分段设计引物,前半段好不容易出现条带,去测序,可又什么也不是,好心累,求各位大神指导下

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hx814102

新虫 (正式写手)

肯定模板或引物有一个出了问题

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Everydayisanewday!
2楼2017-06-19 18:18:46
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薄荷颜料

新虫 (初入文坛)

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-06-20 23:09:52
1,表达部位
你的cdna取的是什么材料什么部位的?或许你要的基因在这个部位根本不表达?换个部位试试?
2,用基因组做pcr扩基因
如果是过表达,那最后转录翻译都是一样的,如果是看定位什么的,就有差异了
3,换个模板
问师兄师姐师弟师妹还有其他实验室的战友们借一个吧,或者换个人给你p一下,全部用他的试剂
4楼2017-06-20 21:45:45
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普通回帖

hhz09423

金虫 (正式写手)

3楼2017-06-19 19:52:54
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往阳光多处走

新虫 (小有名气)

你克的是什么?需不需要前期诱导再去提RNA?

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5楼2017-06-21 07:56:27
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stabilized

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你加个阳性对照,看看是不是cDNA不行
坚持!
6楼2017-06-21 08:44:46
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18388248062

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hx814102 at 2017-06-19 18:18:46
肯定模板或引物有一个出了问题

模板没问题呢

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7楼2017-06-21 17:21:47
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18388248062

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 往阳光多处走 at 2017-06-21 07:56:27
你克的是什么?需不需要前期诱导再去提RNA?

合成葡甘聚糖基因CSLA3

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8楼2017-06-21 17:22:31
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18388248062

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 薄荷颜料 at 2017-06-20 21:45:45
1,表达部位
你的cdna取的是什么材料什么部位的?或许你要的基因在这个部位根本不表达?换个部位试试?
2,用基因组做pcr扩基因
如果是过表达,那最后转录翻译都是一样的,如果是看定位什么的,就有差异了
3,换 ...

我的那个基因只有在球茎才会有,其他部位没有,我去NCBI上找,找不到基因组,而且我那个基因只有目的片段,ATG…TAG。不像其他基因那样两端有多余的片段,可以设计引物,我这个我导师直接拿两尾做引物,硬是做不出来。心累

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9楼2017-06-21 17:32:04
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18388248062

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by stabilized at 2017-06-21 08:44:46
你加个阳性对照,看看是不是cDNA不行

做过了,可以用

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10楼2017-06-21 17:32:48
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