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18366882927

新虫 (初入文坛)

[求助] 之前做过的PCR重复不出来，求大神帮忙看一下？？急！急！急！不然就得换导师了。 已有3人参与

这是设计的大肠杆菌DH5α引物

F：5，CGCGGATCCATGGCTGTTACTAATGTCG 3，
R：5，CCGCTCGAGTTAAGCGGATTTTTTCG 3，

PCR体系（25ul):
                        模板           ：  2ul
                        Taq酶         ： 0.125ul
                        primer         :  0.625ul
                                           ：0.625ul
                      10xbuffer       : 2.5ul
                      2.5mMdNTP  :  2ul
                       dd水            ： 17.125ul

条件：1.  95℃              4min
          2.  95℃              40s
               61℃              30s
               72℃              3min
          3.  72℃              10min
这是体系和条件，求大神帮忙，帮我找找原因，要崩溃了。。。。。



之前做过的PCR重复不出来，求大神帮忙看一下？？急！急！急！不然就得换导师了。
年前普通Taq酶P的条带.png


之前做过的PCR重复不出来，求大神帮忙看一下？？急！急！急！不然就得换导师了。-1
年前高保真酶primer starP出的条带.png


之前做过的PCR重复不出来，求大神帮忙看一下？？急！急！急！不然就得换导师了。-2
年后普通taq酶P的，没有条带.png


之前做过的PCR重复不出来，求大神帮忙看一下？？急！急！急！不然就得换导师了。-3
1.jpg


之前做过的PCR重复不出来，求大神帮忙看一下？？急！急！急！不然就得换导师了。-4
2.jpg
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1楼 2017-03-27 16:45:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

姜三胖

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-03-28 07:43:53
首先可以将模板跑个电泳看下模板是否被降解，其次稍微降低一下你的退火温度，降至55度，并提高下循环数，如33个循环，看看是否有目的片段扩增出来，如果有，将片段切下来纯化之后再当模板做一次pcr

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6楼2017-03-28 00:43:17
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科学小覃

木虫 (正式写手)
3k，这个片段有点大，是不是考虑一下模版可能降解了，加大模版量看看（10ul)，要么重提
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生物科学
3楼2017-03-27 17:28:06
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
真有可能是模版的问题

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4楼2017-03-27 20:41:53
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匿名

用户注销 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖仅楼主可见
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7楼2017-03-28 10:14:15
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18366882927

新虫 (初入文坛)
我的基因是2600多bp，接近3kb的。

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2楼2017-03-27 16:56:13
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凌树枯草

新虫 (初入文坛)
模板是菌液还是质粒？还有就是Taq酶

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5楼2017-03-27 20:42:09
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伤逝1990

金虫 (小有名气)
用kod酶试试，

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8楼2017-03-28 13:45:14
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fanray110

木虫 (正式写手)
感觉是模板的问题

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人常在什么都可以自由自在的时候，却被这种随心所欲的自由蒙蔽，虚掷时光而毫无知觉！
9楼2017-03-28 13:47:52
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18366882927

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 科学小覃 at 2017-03-27 17:28:06
3k，这个片段有点大，是不是考虑一下模版可能降解了，加大模版量看看（10ul)，要么重提

模板是菌液，过夜摇和复摇的，应该问题不大，昨天我同学帮我p的，p出来了，我现在怀疑是不是酶的问题。

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10楼2017-03-29 10:11:32
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