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细胞工程（Cell engineering）是指主要以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。
◆研究对象：动植物细胞（原生质体），也包括细胞器、染色体、细胞核、胚胎。
细胞凋亡（apoptosis）：指机体为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性死亡。
◆细胞坏死（necrosis）：是细胞受到物理因素（如热、辐射）、化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）或生物因素（如病原体）作用，引起细胞无序变化的死亡过程。
  贴壁型生长细胞:附着在某一固相支持物表面才能       生长的细胞。
悬浮型生长细胞:不必附着于固相支持物表面，在悬浮状态下即可生长的细胞。
二）悬浮生长型
   培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使之保持悬浮状态生长的细胞叫悬浮生长型细胞。
特点：不贴附在支持物上生长，胞体圆形。
优点：在培养液中生长空间大，提供数量大；
   传代方便(只需稀释而不需消化处理)；
   可长时间生长，繁殖旺盛便于做细胞代谢研究。
缺点：观察不方便
   很多细胞不能悬浮生长

  悬浮生长型细胞与贴附生长型细胞相比，  具有哪些优点和缺点？
优点：在培养液中生长空间大，提供数量大；
   传代方便(不需消化)；
   可长时间生长，繁殖旺盛便于做细胞代谢研究。
缺点：观察不方便
   很多细胞不能悬浮生长

细胞在体外生长时具有贴附、接触抑制和密度依赖性三大特点。

接触抑制可作为区别正常细胞与肿瘤细胞的标志之一。
正常细胞生长密度过大时，细胞变得拥挤，生存空间消失，同时培养基中的营养物被逐渐消耗掉，代谢产物增多，细胞停止分裂增殖，这种特性称为密度抑制

思考题4：体外培养的细胞具有哪些生长特点？
   体外培养细胞重要的生长特点有：贴附并伸展以及接触抑制和生长的密度依赖性。
   贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。大多数细胞在体外均附着于一定的底物而生长。培养细胞在未贴附于底物之前均似圆球样，当与底物贴附后，细胞逐渐伸展而形成一定的形态
接触抑制是由于细胞相互接触而抑制细胞运动性的现象。正常细胞不会发生相互重叠，而是呈单层细胞生长。
   密度抑制是当细胞密度达到一定程度后，营养相对缺乏，代谢产物增多，细胞受营养的枯竭和代谢物的影响而发生的现象，此时细胞停止分裂。

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。

思考题5：体外培养细胞的生命期包括哪几个时期？  每一时期的细胞具有哪些特点？
包括原代培养期、传代培养期及衰退期。
原代培养期：细胞移动活跃；可见细胞分裂，但不旺盛；呈二倍体核型；与体内原组织的形态结构和功能基本相似。
传代培养期：细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型。
衰退期：细胞增殖减慢，轮廓逐渐增强，走向       衰退凋亡。

生物学意义：
原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养，故更接近于生物体内的生活状态。为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段；
作为传代培养的基本条件；
可直接服务于临床实践，进行药物测试。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对化疗药物的敏感性来选择最有效的化疗方案

二、体外培养细胞有哪些类型？其生长特点有什么区别？
         成纤维型细胞
贴壁型细胞上皮型细胞
         游走型细胞
         多形型细胞

悬浮型细胞
生长特点从形态、生长形式等加以区别比较

潜伏期、指数生长期和停滞期。
细胞有代谢及运动，但无增殖。细胞分裂相增多时，标志细胞进入指数生长期
  细胞增殖最旺盛阶段，分裂相增多，活力最佳
  细胞不增殖，有代谢活动。
血清存在的问题 1. 存在有害于细胞生长和繁殖的物质。如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子。
2. 成分不明确，影响对结果的分析。
3. 不同动物、不同批次的血清和活性差别较大，使培养的结果不稳定。

问题1:体外培养的细胞需要哪些物质？
   水、糖、氨基酸、维生素、无机离子和微量元素、血清和促生长因子。

问题2：体外培养的哺乳动物细胞需要在什么环境下生长？如何获得这些环境？
温度：36.5±0.5℃
pH：7.1~7.3
渗透压：260~320mOsm/kg
气体：95% O2和5%CO2

微生物污染细胞后的现象对比：
细菌：增殖快，短时间在数量上压过细胞产生毒素杀死细胞。
真菌：种类繁多，形态各异，呈白色或浅黄色小点，飘浮于培养液面，肉眼可见。
支原体、病毒：无致死毒性，对细胞形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的，短时间内不易被发现。

问题2：胎牛血清在细胞培养中起什么作用？
1.补充培养液中没有或量不足的营养物质；
2.提供激素和各种生长因子；
3. 提供结合蛋白；
4. 含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上；
5. 对培养中的细胞起到保护作用。

问题7：组织块培养3~5天后换液的目的是什么？
1、补充营养；
2、去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

问题8：细胞传代培养和细胞分裂之间有何关系？细胞传代培养1次是细胞分裂1次吗？
   细胞一代中，细胞分裂多次，细胞数量增加，达到饱和密度时进行传代培养。

问题9：微生物的污染主要包括哪些类型？怎样判断培养的细胞污染了何种微生物？
细菌、真菌、支原体和病毒污染。
细菌污染：培养液变混浊，胞内颗粒增多，细胞变圆脱落死亡。
真菌污染：培养液中漂浮白色或浅黄色的小点，镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝。
支原体污染：相差显微镜观察，地衣红染色观察，荧光染色法观察，电镜检测，培养检测。
病毒污染：电镜检测，RT-PCR。

体外受精的早期胚胎在体外发育中，往往会停止在某一阶段不再发育，这种现象称为发育阻滞

同核体（homokaryon）：由同一基因型亲本细胞融合而来。
异核体（heterokaryon）：由不同基因型亲本胞融合而来。

二、细胞融合的主要过程
细胞在诱导剂或正弦电场作用下凝聚，彼此靠近；
两个相邻细胞之间的质膜相互融合；质膜上的受体、糖蛋白等质膜成分在融合后的质膜上重新分布；
细胞质发生融合；
细胞核融合，形成融合细胞

人工诱导细胞融合的方法：
病毒诱导：灭活的仙台病毒化学诱导：PEG、Ca2+、溶血卵磷脂等物理诱导：电诱导

常用方法有：抗药性筛选；营养缺陷型筛选；温度敏感型筛选等。

抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质

B淋巴细胞接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能       短命细胞          保证骨髓瘤细胞处于对数生长期
常用克隆化方法：有限稀释法  软琼脂平板法  显微操作法

问题：整个制备过程为何要经过两次筛选?
第一次筛选：用特定的选择培养基筛选出多种杂交瘤细胞，但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需抗体的细胞。
第二次筛选（克隆化培养和抗体检测）：筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。

悬浮培养的优点：
操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧效果比较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可以借鉴许多细菌发酵的经验。
◆悬浮培养的缺点：
不能采用灌流培养，导致细胞密度较低，另外只有少数细胞适合悬浮培养。

贴壁培养的优点：
容易更换培养液；容易采用灌注式培养、不需过滤系统；同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例、适用于所有类型细胞。
◆贴壁培养的缺点：
扩大培养比较困难，投资大，占地面积大；不能有效监测细胞的生长。

动物细胞贴壁生长的主要环节有哪些？
1、潜伏期：
（1）游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮状态。
（2）吸附期：不同类型的细胞贴壁时间有所差异。
2、对数生长期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。随着细胞数量增多，细胞间开始接触并连接成片，出现接触性抑制。
3、停滞期：细胞长满载体表面，随着营养物消耗和代谢物积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。如不及时传代培养，细胞脱落死亡

（二）大规模培养技术的操作方式
1、分批式培养2、流加式培养3、半连续式培养4、连续式培养 5、灌注式培养
2、动物细胞培养的缺点：
①体外培养的动物细胞对营养的要求较高。
②动物细胞生长缓慢，对环境条件要求严格。
③体外培养的细胞与体内生长的细胞存在或多或少的差异
2、培养方法的发展
◆双盖片悬滴培养法 ◆旋转管培养的方法 ◆灌注小室培养法
良好微载体的特点：
1、好的生物相容性：无毒无害；2、好的黏附性：适于细胞附着、伸展和增殖，一般带正电荷；3、大的比表面积：颗粒均匀，孔径均一； 4、良好的传质性能；5、强的机械性能：保护细胞、重复利用；6、好的热稳定性：适合高压蒸汽灭菌。

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[ Last edited by silicare on 2014-2-18 at 08:11 ]

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