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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 之前做过的PCR重复不出来，求大神帮忙看一下？？急！急！急！不然就得换导师了。
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18366882927

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 伤逝1990 at 2017-03-28 13:45:14
用kod酶试试，

这个酶好用吗？

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11楼2017-03-29 10:11:52
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18366882927

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌树枯草 at 2017-03-27 20:42:09
模板是菌液还是质粒？还有就是Taq酶

模板是菌液，用的是普通的Taq酶，到我同学昨天用他们实验室的酶p出来了，所以我现在怀疑是不是酶的问题，要不就是我操作的问题。

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12楼2017-03-29 10:13:07
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18366882927

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 姜三胖 at 2017-03-28 00:43:17
首先可以将模板跑个电泳看下模板是否被降解，其次稍微降低一下你的退火温度，降至55度，并提高下循环数，如33个循环，看看是否有目的片段扩增出来，如果有，将片段切下来纯化之后再当模板做一次pcr
...

好的，谢谢。我试一下。

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13楼2017-03-29 10:13:35
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chenshuai1238

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR反应最重要的是酶，taq酶有点差对于这么长的序列。可以考虑用一下phusion酶或者Q5酶，很好用的。还有可以考虑手动hot-start进行pcr，也就是在体系温度达到98度的时候，再往里面加酶，可以减少很多碎片序列的产生
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14楼2017-03-29 11:17:04
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2016-li

新虫 (初入文坛)
会不会是模板出了问题呢，跑一个模板的看看

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15楼2017-03-30 13:24:52
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浩月照沧海

木虫 (小有名气)
酶太少了，加10ul

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16楼2017-03-30 17:16:57
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孔飞东落

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 18366882927 at 2017-03-29 10:11:32
模板是菌液，过夜摇和复摇的，应该问题不大，昨天我同学帮我p的，p出来了，我现在怀疑是不是酶的问题。
...

酶很容易出问题，有可能有人没注意就失活了
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17楼2017-03-30 18:46:58
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zgs_2013

银虫 (小有名气)
如果别人扩增可以，那很可能是酶的问题，换一管新酶试试，现在mix的酶很好用，不用自己配酶体系。

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18楼2017-03-31 17:51:17
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

根据以前的实验结论，基因组模板有问题的可能性很大，你可以提出来P下试试
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19楼2017-09-05 19:06:28
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