应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
471/5返回列表12345下一页
查看: 1602  |  回复: 46
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

549088894

新虫 (小有名气)

[求助] 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？ 已有6人参与

求大神帮忙看看，如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基从5’端补充上去，如何设计引物？这样是不是要在原始上游引物上加上33bp？这样引物是不是要设计成五十多bp？这样可行吗？谢谢

@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-10-24 13:54:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kuaile5420: 金币+2, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-10-24 21:06:08
应该是可行的，我做融合PCR的时候，引物长度用过46bp，扩增没问题。建议如下：
1.将你的33个碱基附在引物后面，注意序列正确性，保证读码框的正确性。
2.应以原始引物的Tm值（不含这33个碱基）作为参考来设置退火温度。
3.引物太长，有时候引物自身会形成二级结构影响扩增效率，可以在扩增前处理下引物（如沸水浴变性后立即置冰上）。
4.保证模板的质量可提高扩增效率，选用质量较高的模板，如质粒或者纯化过的目标片段。
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2016-10-24 15:51:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
32楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 19:00:30
如果还想加个酶切位点，那我退火温度是按上下游除去33bp及酶切位点的Tm值相加，除以2？
...

嗯，然后p的时候减5

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
···
34楼2016-10-31 19:07:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

无知的小强

木虫 (正式写手)
我觉得可以，就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过，知道前面的序列，为什么不重新设计一个引物呢？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
2楼2016-10-24 14:04:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无知的小强 at 2016-10-24 14:04:39
我觉得可以，就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过，知道前面的序列，为什么不重新设计一个引物呢？

看到有文献是说两个物种不同，然后人的缺了N端33个碱基，如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低，所以只能通过这种方法加上去

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-10-24 14:13:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

无知的小强

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-24 14:13:35
看到有文献是说两个物种不同，然后人的缺了N端33个碱基，如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低，所以只能通过这种方法加上去
...

我觉得如果有前边序列信息的话（其他近缘物种也行），重新设计比较好。

如果在引物上＋33个碱基，熔解温度啥的不好弄了。

别的就不知道啦

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
4楼2016-10-24 14:20:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 无知的小强 at 2016-10-24 14:20:09
我觉得如果有前边序列信息的话（其他近缘物种也行），重新设计比较好。
如果在引物上＋33个碱基，熔解温度啥的不好弄了。
别的就不知道啦
...

如果是这样子的话能通过采用其他近缘物种进行设计引物，再以我自己这个物种提取的DNA作为模版扩增？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
5楼2016-10-24 15:01:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

C小杨

新虫 (初入文坛)
50多bp不是问题，更长的引物我们都用过。祝好！

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
7楼2016-10-24 16:09:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

生物技术专业

铁虫 (小有名气)
不会

发自小木虫Android客户端
回复此楼
8楼2016-10-24 18:05:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangtzelv

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
完全没问题
轻松可克隆出
赞一下 回复此楼
9楼2016-10-25 09:49:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wugenpeng

新虫 (初入文坛)
我用过最长的，包括保护碱基，一共51bp，应该没问题，
赞一下 回复此楼
10楼2016-10-25 10:28:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 549088894 的主题更新
471/5返回列表12345下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂，一志愿郑州大学材料与化工专硕，英二数二342分，求老师收留 +5 v12abo 2026-04-02 5/250 2026-04-02 18:53 by 010518
[考研] 调剂求助 +4 想换手机不想解� 2026-04-02 4/200 2026-04-02 18:14 by 乔哒哒哒
[考研] 310求调剂 +17 争取九点睡 2026-03-30 17/850 2026-04-02 16:40 by guanxin1001
[考研] 求调剂推荐 +3 南山南@ 2026-04-01 3/150 2026-04-02 12:09 by xiaoranmu
[考研] 271求调剂 +15 勒布朗@ 2026-03-31 20/1000 2026-04-02 11:24 by Sammy2
[考研] 生物学308分求调剂（一志愿华东师大） +5 相信必会光芒万� 2026-03-31 6/300 2026-04-02 10:16 by guoweigw
[考研] 一志愿安徽大学计算机科学与技术学硕，331分求调剂 +5 蒋昌鹏qtj 2026-04-01 5/250 2026-04-02 08:10 by fxue1114
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +8 邱gl 2026-03-30 16/800 2026-04-01 17:58 by 邱gl
[考研] 0703求调剂 +4 zizimo 2026-03-31 4/200 2026-04-01 16:04 by yanflower7133
[考研] 调剂 +5 好好读书。 2026-03-28 7/350 2026-04-01 15:32 by 王亮_大连医科大
[考研] 求调剂 +4 图鉴212 2026-03-30 5/250 2026-04-01 15:32 by 图鉴212
[考研] 土木304求调剂 +3 兔突突突， 2026-03-31 3/150 2026-04-01 09:42 by JourneyLucky
[考研] 一志愿：西北大学，英一数一408-284分求调剂 +7 12.27 2026-03-27 7/350 2026-03-31 21:59 by lbsjt
[考研] 一志愿大连理工大学，机械工程学硕，341 +3 西瓜田的守望者 2026-03-30 3/150 2026-03-31 11:08 by asdfzly
[考研] 327求调剂 +5 小卡不卡. 2026-03-29 5/250 2026-03-30 19:30 by Wang200018
[考研] 317分 一志愿南理工材料工程 本科湖工大 求调剂 +12 芋泥小铃铛 2026-03-28 12/600 2026-03-30 17:06 by wangjy2002
[考研] 环境科学与工程334分求调剂 +6 王一一依依 2026-03-30 8/400 2026-03-30 11:52 by yjolah
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-03-27 6/300 2026-03-28 14:10 by 唐沐儿
[考研] 340求调剂 +5 jhx777 2026-03-27 5/250 2026-03-28 04:18 by fmesaito
[考研] 266求调剂 +11 阳阳哇塞 2026-03-27 12/600 2026-03-27 17:56 by yu221
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭