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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？
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549088894

新虫 (小有名气)

[求助] 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？ 已有6人参与

求大神帮忙看看，如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基从5’端补充上去，如何设计引物？这样是不是要在原始上游引物上加上33bp？这样引物是不是要设计成五十多bp？这样可行吗？谢谢

@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2016-10-24 13:54:12
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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kuaile5420: 金币+2, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-10-24 21:06:08
应该是可行的，我做融合PCR的时候，引物长度用过46bp，扩增没问题。建议如下：
1.将你的33个碱基附在引物后面，注意序列正确性，保证读码框的正确性。
2.应以原始引物的Tm值（不含这33个碱基）作为参考来设置退火温度。
3.引物太长，有时候引物自身会形成二级结构影响扩增效率，可以在扩增前处理下引物（如沸水浴变性后立即置冰上）。
4.保证模板的质量可提高扩增效率，选用质量较高的模板，如质粒或者纯化过的目标片段。
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6楼2016-10-24 15:51:02
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
32楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 19:00:30
如果还想加个酶切位点，那我退火温度是按上下游除去33bp及酶切位点的Tm值相加，除以2？
...

嗯，然后p的时候减5

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···
34楼2016-10-31 19:07:28
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普通回帖

无知的小强

木虫 (正式写手)
我觉得可以，就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过，知道前面的序列，为什么不重新设计一个引物呢？

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Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
2楼2016-10-24 14:04:39
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549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无知的小强 at 2016-10-24 14:04:39
我觉得可以，就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过，知道前面的序列，为什么不重新设计一个引物呢？

看到有文献是说两个物种不同，然后人的缺了N端33个碱基，如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低，所以只能通过这种方法加上去

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3楼2016-10-24 14:13:35
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无知的小强

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-24 14:13:35
看到有文献是说两个物种不同，然后人的缺了N端33个碱基，如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低，所以只能通过这种方法加上去
...

我觉得如果有前边序列信息的话（其他近缘物种也行），重新设计比较好。

如果在引物上＋33个碱基，熔解温度啥的不好弄了。

别的就不知道啦

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Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
4楼2016-10-24 14:20:09
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549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 无知的小强 at 2016-10-24 14:20:09
我觉得如果有前边序列信息的话（其他近缘物种也行），重新设计比较好。
如果在引物上＋33个碱基，熔解温度啥的不好弄了。
别的就不知道啦
...

如果是这样子的话能通过采用其他近缘物种进行设计引物，再以我自己这个物种提取的DNA作为模版扩增？

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5楼2016-10-24 15:01:50
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C小杨

新虫 (初入文坛)
50多bp不是问题，更长的引物我们都用过。祝好！

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7楼2016-10-24 16:09:47
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生物技术专业

铁虫 (小有名气)
不会

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8楼2016-10-24 18:05:30
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yangtzelv

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
完全没问题
轻松可克隆出
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9楼2016-10-25 09:49:59
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wugenpeng

新虫 (初入文坛)
我用过最长的，包括保护碱基，一共51bp，应该没问题，
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10楼2016-10-25 10:28:34
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