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549088894

新虫 (小有名气)

[求助] 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去,如何设计引物? 已有6人参与

求大神帮忙看看,如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基从5’端补充上去,如何设计引物?这样是不是要在原始上游引物上加上33bp?这样引物是不是要设计成五十多bp?这样可行吗?谢谢

@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kuaile5420: 金币+2, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-10-24 21:06:08
应该是可行的,我做融合PCR的时候,引物长度用过46bp,扩增没问题。建议如下:
1.将你的33个碱基附在引物后面,注意序列正确性,保证读码框的正确性。
2.应以原始引物的Tm值(不含这33个碱基)作为参考来设置退火温度。
3.引物太长,有时候引物自身会形成二级结构影响扩增效率,可以在扩增前处理下引物(如沸水浴变性后立即置冰上)。
4.保证模板的质量可提高扩增效率,选用质量较高的模板,如质粒或者纯化过的目标片段。
6楼2016-10-24 15:51:02
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无知的小强

木虫 (正式写手)

我觉得可以,就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过,知道前面的序列,为什么不重新设计一个引物呢?

发自小木虫Android客户端
Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
2楼2016-10-24 14:04:39
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549088894

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 无知的小强 at 2016-10-24 14:04:39
我觉得可以,就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过,知道前面的序列,为什么不重新设计一个引物呢?

看到有文献是说两个物种不同,然后人的缺了N端33个碱基,如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低,所以只能通过这种方法加上去

发自小木虫IOS客户端
3楼2016-10-24 14:13:35
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无知的小强

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-24 14:13:35
看到有文献是说两个物种不同,然后人的缺了N端33个碱基,如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低,所以只能通过这种方法加上去
...

我觉得如果有前边序列信息的话(其他近缘物种也行),重新设计比较好。

如果在引物上+33个碱基,熔解温度啥的不好弄了。

别的就不知道啦

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Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
4楼2016-10-24 14:20:09
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