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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？
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549088894

新虫 (小有名气)
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39楼: Originally posted by wugenpeng at 2016-11-02 09:16:34
Tm值加的片段不算，...

是指加的33bp以及酶切位点片段不算吗？
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41楼2016-11-04 22:20:36
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新虫 (小有名气)
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37楼: Originally posted by C小杨 at 2016-11-01 09:43:34
退火温度按照另外一条短的引物的就好了。质粒等简单模板的话很容易扩增，基因组等复杂模板的话也许会有杂带，那就切个胶或者设计带和不带33bp两条引物，先用短的扩增个单一模板出来，再用长的扩增。我们经常用长40 ...

恩，我去试试，谢谢
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42楼2016-11-04 22:21:05
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549088894

新虫 (小有名气)
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36楼: Originally posted by winyuyuyu123 at 2016-11-01 08:29:56
是的，就是加在引物的5’端，至于是加在正向引物还是反向，就看你要掺入到序列的哪一端了
...

恩，好的，谢谢
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43楼2016-11-04 22:21:22
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549088894

新虫 (小有名气)
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35楼: Originally posted by WilliamHJ at 2016-11-01 07:44:48
可以，或者选用较低的那个就行
...

好的，谢谢
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44楼2016-11-04 22:21:38
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549088894

新虫 (小有名气)
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34楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-31 19:07:28
嗯，然后p的时候减5
...

恩，谢谢
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45楼2016-11-04 22:21:49
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新虫 (小有名气)
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31楼: Originally posted by WilliamHJ at 2016-10-31 15:28:48
你不放心的话，可以先用配对区的退火温度扩增5个循环，再用全长退火温度接着扩增25-30个循环就好了。如果全长退火温度大于延伸温度就设成延伸温度
...

你好，我想请教下你有没有做过融合PCR？我看到有人说：取两对引物扩增的PCR产物（不回收）等体积混合作为模板，配成25微升的反应体系（含Taq酶、缓冲液、dNTP），94℃4min，95℃40s、54℃1min、72℃1.5min扩增5个循环后（该步骤不加引物）【我想请教下该步骤的延伸时间是指两片段长度之和算的？还是？】，5个循环后，另加入25微升的反应液（含Taq酶、缓冲液、dNTP以及所设计的融合基因上下游引物），94℃4min，95℃40s、54℃45s、72℃1min、循环30x，72℃ 10min【该步骤循环内的延伸温度又是如何确定？为何比之前的5循环短一些？】
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46楼2016-11-04 22:42:42
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新虫 (小有名气)
引用回帖:
34楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-31 19:07:28
嗯，然后p的时候减5
...

你好，我想请教下你有没有做过融合PCR？我看到有人说：取两对引物扩增的PCR产物（不回收）等体积混合作为模板，配成25微升的反应体系（含Taq酶、缓冲液、dNTP），94℃4min，95℃40s、54℃1min、72℃1.5min扩增5个循环后（该步骤不加引物）【我想请教下该步骤的延伸时间是指两片段长度之和算的？还是？】，5个循环后，另加入25微升的反应液（含Taq酶、缓冲液、dNTP以及所设计的融合基因上下游引物），94℃4min，95℃40s、54℃45s、72℃1min、循环30x，72℃ 10min【该步骤循环内的延伸温度又是如何确定？为何比之前的5循环短一些？】
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47楼2016-11-04 22:43:02
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