应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？
54/1返回列表
查看: 1503  |  回复: 46
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

549088894

新虫 (小有名气)

[求助] 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？ 已有6人参与

求大神帮忙看看，如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基从5’端补充上去，如何设计引物？这样是不是要在原始上游引物上加上33bp？这样引物是不是要设计成五十多bp？这样可行吗？谢谢

@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-10-24 13:54:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

C小杨

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 14:58:29
请教下你退火温度该如何设置？加了33bp后退火温度高于延伸温度了
...

退火温度按照另外一条短的引物的就好了。质粒等简单模板的话很容易扩增，基因组等复杂模板的话也许会有杂带，那就切个胶或者设计带和不带33bp两条引物，先用短的扩增个单一模板出来，再用长的扩增。我们经常用长40-60bp和约20bp两条引物扩质粒，58度左右退火，很容易。
赞一下 回复此楼
37楼2016-11-01 09:43:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 47 个回答

无知的小强

木虫 (正式写手)
我觉得可以，就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过，知道前面的序列，为什么不重新设计一个引物呢？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
2楼2016-10-24 14:04:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无知的小强 at 2016-10-24 14:04:39
我觉得可以，就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过，知道前面的序列，为什么不重新设计一个引物呢？

看到有文献是说两个物种不同，然后人的缺了N端33个碱基，如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低，所以只能通过这种方法加上去

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-10-24 14:13:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

无知的小强

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-24 14:13:35
看到有文献是说两个物种不同，然后人的缺了N端33个碱基，如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低，所以只能通过这种方法加上去
...

我觉得如果有前边序列信息的话（其他近缘物种也行），重新设计比较好。

如果在引物上＋33个碱基，熔解温度啥的不好弄了。

别的就不知道啦

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
4楼2016-10-24 14:20:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 47 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭