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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？
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549088894

新虫 (小有名气)

[求助] 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？ 已有6人参与

求大神帮忙看看，如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基从5’端补充上去，如何设计引物？这样是不是要在原始上游引物上加上33bp？这样引物是不是要设计成五十多bp？这样可行吗？谢谢

@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2016-10-24 13:54:12
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549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
34楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-31 19:07:28
嗯，然后p的时候减5
...

你好，我想请教下你有没有做过融合PCR？我看到有人说：取两对引物扩增的PCR产物（不回收）等体积混合作为模板，配成25微升的反应体系（含Taq酶、缓冲液、dNTP），94℃4min，95℃40s、54℃1min、72℃1.5min扩增5个循环后（该步骤不加引物）【我想请教下该步骤的延伸时间是指两片段长度之和算的？还是？】，5个循环后，另加入25微升的反应液（含Taq酶、缓冲液、dNTP以及所设计的融合基因上下游引物），94℃4min，95℃40s、54℃45s、72℃1min、循环30x，72℃ 10min【该步骤循环内的延伸温度又是如何确定？为何比之前的5循环短一些？】
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47楼2016-11-04 22:43:02
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无知的小强

木虫 (正式写手)
我觉得可以，就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过，知道前面的序列，为什么不重新设计一个引物呢？

发自小木虫Android客户端
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Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
2楼2016-10-24 14:04:39
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549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无知的小强 at 2016-10-24 14:04:39
我觉得可以，就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过，知道前面的序列，为什么不重新设计一个引物呢？

看到有文献是说两个物种不同，然后人的缺了N端33个碱基，如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低，所以只能通过这种方法加上去

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3楼2016-10-24 14:13:35
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无知的小强

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-24 14:13:35
看到有文献是说两个物种不同，然后人的缺了N端33个碱基，如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低，所以只能通过这种方法加上去
...

我觉得如果有前边序列信息的话（其他近缘物种也行），重新设计比较好。

如果在引物上＋33个碱基，熔解温度啥的不好弄了。

别的就不知道啦

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Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
4楼2016-10-24 14:20:09
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