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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？
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WilliamHJ

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
29楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 15:12:07
这个扩增几轮后模版不就存在有加了33bp的片段了吗？退火温度还对吗？
...

你不放心的话，可以先用配对区的退火温度扩增5个循环，再用全长退火温度接着扩增25-30个循环就好了。如果全长退火温度大于延伸温度就设成延伸温度

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31楼2016-10-31 15:28:48
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549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
30楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-31 15:15:34
对的，影响不会太大，完全可以p出来的
...

如果还想加个酶切位点，那我退火温度是按上下游除去33bp及酶切位点的Tm值相加，除以2？

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32楼2016-10-31 19:00:30
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549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
31楼: Originally posted by WilliamHJ at 2016-10-31 15:28:48
你不放心的话，可以先用配对区的退火温度扩增5个循环，再用全长退火温度接着扩增25-30个循环就好了。如果全长退火温度大于延伸温度就设成延伸温度
...

如果还想加个酶切位点，那我退火温度是按上下游除去33bp及酶切位点的Tm值相加，除以2？

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33楼2016-10-31 19:00:40
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
32楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 19:00:30
如果还想加个酶切位点，那我退火温度是按上下游除去33bp及酶切位点的Tm值相加，除以2？
...

嗯，然后p的时候减5

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···
34楼2016-10-31 19:07:28
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WilliamHJ

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
33楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 19:00:40
如果还想加个酶切位点，那我退火温度是按上下游除去33bp及酶切位点的Tm值相加，除以2？
...

可以，或者选用较低的那个就行

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35楼2016-11-01 07:44:48
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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 14:56:47
我想请教下将33个碱基附在引物后边是什么意思？我是要将它加到模版上，应该是在引物前边吧？这样类似于加酶切位点？
...

是的，就是加在引物的5’端，至于是加在正向引物还是反向，就看你要掺入到序列的哪一端了

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36楼2016-11-01 08:29:56
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C小杨

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 14:58:29
请教下你退火温度该如何设置？加了33bp后退火温度高于延伸温度了
...

退火温度按照另外一条短的引物的就好了。质粒等简单模板的话很容易扩增，基因组等复杂模板的话也许会有杂带，那就切个胶或者设计带和不带33bp两条引物，先用短的扩增个单一模板出来，再用长的扩增。我们经常用长40-60bp和约20bp两条引物扩质粒，58度左右退火，很容易。
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37楼2016-11-01 09:43:34
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Hauber

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 15:04:10
你最多用到多少bp？请教下你退火温度该如何设置？加了33bp后退火温度高于延伸温度了，引物过长如何防止自身引物结合？
...

由于我做的这个片段太短只有30多bp，因为要做融合跟师兄的片段连在一起，然后设计引物的时候就把我的这个碱基全部加到师兄引物的5'端，然后用参照师兄的那个退火温度做了个温度梯度，摸索了一下

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38楼2016-11-01 10:46:41
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wugenpeng

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 15:00:26
请教下你退火温度该如何设置？加了33bp后退火温度高于延伸温度了
...

Tm值加的片段不算，
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39楼2016-11-02 09:16:34
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549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
38楼: Originally posted by Hauber at 2016-11-01 10:46:41
由于我做的这个片段太短只有30多bp，因为要做融合跟师兄的片段连在一起，然后设计引物的时候就把我的这个碱基全部加到师兄引物的5'端，然后用参照师兄的那个退火温度做了个温度梯度，摸索了一下
...

好的，谢谢
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40楼2016-11-04 22:19:48
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