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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？
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549088894

新虫 (小有名气)

[求助] 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？ 已有6人参与

求大神帮忙看看，如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基从5’端补充上去，如何设计引物？这样是不是要在原始上游引物上加上33bp？这样引物是不是要设计成五十多bp？这样可行吗？谢谢

@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2016-10-24 13:54:12
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
32楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 19:00:30
如果还想加个酶切位点，那我退火温度是按上下游除去33bp及酶切位点的Tm值相加，除以2？
...

嗯，然后p的时候减5

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···
34楼2016-10-31 19:07:28
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无知的小强

木虫 (正式写手)
我觉得可以，就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过，知道前面的序列，为什么不重新设计一个引物呢？

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Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
2楼2016-10-24 14:04:39
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549088894

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无知的小强 at 2016-10-24 14:04:39
我觉得可以，就跟高通量测序需要barcode一样。                     不过，知道前面的序列，为什么不重新设计一个引物呢？

看到有文献是说两个物种不同，然后人的缺了N端33个碱基，如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低，所以只能通过这种方法加上去

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3楼2016-10-24 14:13:35
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无知的小强

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-24 14:13:35
看到有文献是说两个物种不同，然后人的缺了N端33个碱基，如果是体外克隆表达缺了这33个碱基会造成活性的降低，所以只能通过这种方法加上去
...

我觉得如果有前边序列信息的话（其他近缘物种也行），重新设计比较好。

如果在引物上＋33个碱基，熔解温度啥的不好弄了。

别的就不知道啦

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Behind the mask is an idea, and ideas are bulletproof.
4楼2016-10-24 14:20:09
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