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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如果是想用PCR将基因片段上没有的33个碱基补充上去，如何设计引物？
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549088894

新虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by wugenpeng at 2016-10-25 10:28:34
我用过最长的，包括保护碱基，一共51bp，应该没问题，

请教下你退火温度该如何设置？加了33bp后退火温度高于延伸温度了

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21楼2016-10-31 15:00:26
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549088894

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11楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-25 14:34:23
可以的，没问题的，敲除的时候还有用7-80bp的呢，50多不算啥，就当是酶切位点了

请教下你退火温度该如何设置？加了33bp后退火温度高于延伸温度了，如何防止引物内部自身结合？

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22楼2016-10-31 15:01:19
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12楼: Originally posted by firefly22 at 2016-10-25 22:03:59
可以试试exnase酶的同源重组突变的方式

能否详细点介绍下

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23楼2016-10-31 15:02:56
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13楼: Originally posted by WilliamHJ at 2016-10-26 19:34:44
可行的，我经常用长引物的

你最多用到多少bp？请教下你退火温度该如何设置？加了33bp后退火温度高于延伸温度了，引物过长如何防止自身引物结合？

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24楼2016-10-31 15:04:10
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小冀-

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【答案】应助回帖

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22楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 15:01:19
请教下你退火温度该如何设置？加了33bp后退火温度高于延伸温度了，如何防止引物内部自身结合？
...

退火温度只按配对部分计算，酶切位点不算在里边

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···
25楼2016-10-31 15:06:09
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14楼: Originally posted by Hauber at 2016-10-27 08:41:19
可以的，我现在做融合pcr，引物60多bp

结果如何？我最近也打算做融合pcr，求交流。请教下你退火温度该如何设置？加了33bp后退火温度高于延伸温度了，引物过长会不会自身结合？

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26楼2016-10-31 15:06:21
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15楼: Originally posted by tfytli at 2016-10-27 11:22:08
这个是可行的，我曾经在5’端加过51个碱基片段，详细的可以私信交流。不过提醒一下，这样设计引物会很贵，非常贵

引物有何特殊要求吗？还请再详细介绍下

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27楼2016-10-31 15:07:45
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17楼: Originally posted by luozie at 2016-10-27 16:51:05
可以，50多bp的引物合成很正常，但是要选择合适的引物纯化方法，PAGE纯化就可行；要求高一点使用HPLC纯化（一般引物合成公司HPLC纯化是先PAGE再HPLC纯化；引物价格较高，2.5元左右/bp）；PCR后连接载体克隆测序验证 ...

引物贵一点到没关系，请教下你退火温度该如何设置？加了33bp后退火温度高于延伸温度了，引物太长自身内部如何防止结合？

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28楼2016-10-31 15:09:27
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25楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-31 15:06:09
退火温度只按配对部分计算，酶切位点不算在里边
...

这个扩增几轮后模版不就存在有加了33bp的片段了吗？退火温度还对吗？

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29楼2016-10-31 15:12:07
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小冀-

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引用回帖:
29楼: Originally posted by 549088894 at 2016-10-31 15:12:07
这个扩增几轮后模版不就存在有加了33bp的片段了吗？退火温度还对吗？
...

对的，影响不会太大，完全可以p出来的

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30楼2016-10-31 15:15:34
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