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TA克隆，连接转化能长菌落，但是菌液PCR鉴定没有结果已有4人参与
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PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收纯化PCR产物，电泳检测条带单一，浓度为50ng/微升。 PCR产物和pMD 18-T 载体连接，连接体系是：PCR产物3.5微升，pMD 18-T vector 1微升，水0.5微升，Solution I 5微升。16℃连接3h，使用的是PCR仪器。 固体LB培养基配制：胰蛋白胨1g，酵母浸粉0.5g，氯化钠1g，加水定容100ml，调节PH为7.5，高温高压灭菌30min，待温度适宜，加入IPTG 20微升，X-gal 100微升，AMP 100微升，倒板。 10微升连接产物全部转入50微升大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入700微升液体LB培养液，37℃恒温摇床200rpm 1h，4000rpm离心5min，弃上清500微升，重悬浮，涂板，37℃过夜培养。我看有些人的实验记录都是12-14h就能挑菌了，但是我的12-15h内很难看清蓝白斑，我一般是等到16-18h之间才能很明显分辨出蓝白斑菌落，这时候才能挑白斑，于1ml 含1微升AMP的液体LB培养液中，37℃恒温摇床复苏8h。 菌液PCR鉴定，10微升体系是：Taq酶0.05微升，buffer 1微升，dNTP 0.8微升，上游引物0.5微升，下游引物0.5微升，菌液1微升0.5微升0.3微升都有做过，加水至10微升。引物使用的是之前PCR扩增引物。反应程序有所改变，95℃预变性时间从之前的5min变成15min。 挑单克隆菌落的时候，看着蓝白斑菌落很明显能分开，并且感觉长势不错，信心满满，但是菌液PCR怎么都没有条带，心都碎了。。。。crying 在半个月之前用同样的方法，不同的基因克隆，还做的不错，测序结果也挺好。 1、有人说插入片段和载体的比例，我算了一下，符合比例的范围啊。 2、不是不长菌落，能区分蓝白斑，只是时间久点，感觉长的还不错。 3、菌液PCR做了梯度，还做了对照，酶等试剂没有问题。 可是还找不到原因原因到底在哪啊。。。。老板不管你中间费了多少劲，没有结果可不行啊。。。求小伙伴儿分析原因，相助  |
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lyzjc: 回帖置顶 2017-03-03 19:46:10
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lyzjc: 回帖置顶 2017-03-03 19:46:10
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谢谢各位回复。 经自己的不断重复摸索，成功连接了一个，并且成功测序。今天做的菌液PCR鉴定也成功扩增出阳性克隆，已送去测序。 1、克隆相关的试剂一个都没有更换。 2、怀疑连接时间不够，把连接时间增加到6h左右。 3、怀疑与菌液浓度有关，把摇菌所加液体LB培养基增加到4ml和2ml，且都有扩增成功。 我认为一般克隆不成功的原因，再排除操作手法的原因之后，最大可能得原因有两点： 1、连接不成功 2、菌液PCR环节出了问题，最有可能就是菌液浓度。 希望给自己，也给大家一个经验参考。 |
15楼2016-10-13 19:46:39
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菌长出来了，应该不是转化的问题，考虑是不是载体问题，会不会自连了，我们用19t，有时候假阳性特别多，p不出来，后来酶切发现全都自连的，后来换个批次就好了 发自小木虫Android客户端 |
7楼2016-09-28 23:54:20
8楼2016-10-01 08:08:29
9楼2016-10-01 08:11:31