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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆，连接转化能长菌落，但是菌液PCR鉴定没有结果
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lyzjc

银虫 (小有名气)

[求助] TA克隆，连接转化能长菌落，但是菌液PCR鉴定没有结果 已有4人参与

PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收纯化PCR产物，电泳检测条带单一，浓度为50ng/微升。

PCR产物和pMD 18-T 载体连接，连接体系是：PCR产物3.5微升，pMD 18-T vector 1微升，水0.5微升，Solution I  5微升。16℃连接3h，使用的是PCR仪器。

固体LB培养基配制：胰蛋白胨1g，酵母浸粉0.5g，氯化钠1g，加水定容100ml，调节PH为7.5，高温高压灭菌30min，待温度适宜，加入IPTG 20微升，X-gal 100微升，AMP 100微升，倒板。

10微升连接产物全部转入50微升大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入700微升液体LB培养液，37℃恒温摇床200rpm   1h，4000rpm离心5min，弃上清500微升，重悬浮，涂板，37℃过夜培养。我看有些人的实验记录都是12-14h就能挑菌了，但是我的12-15h内很难看清蓝白斑，我一般是等到16-18h之间才能很明显分辨出蓝白斑菌落，这时候才能挑白斑，于1ml 含1微升AMP的液体LB培养液中，37℃恒温摇床复苏8h。

菌液PCR鉴定，10微升体系是：Taq酶0.05微升，buffer 1微升，dNTP 0.8微升，上游引物0.5微升，下游引物0.5微升，菌液1微升0.5微升0.3微升都有做过，加水至10微升。引物使用的是之前PCR扩增引物。反应程序有所改变，95℃预变性时间从之前的5min变成15min。
挑单克隆菌落的时候，看着蓝白斑菌落很明显能分开，并且感觉长势不错，信心满满，但是菌液PCR怎么都没有条带，心都碎了。。。。crying

在半个月之前用同样的方法，不同的基因克隆，还做的不错，测序结果也挺好。

1、有人说插入片段和载体的比例，我算了一下，符合比例的范围啊。
2、不是不长菌落，能区分蓝白斑，只是时间久点，感觉长的还不错。
3、菌液PCR做了梯度，还做了对照，酶等试剂没有问题。

可是还找不到原因原因到底在哪啊。。。。老板不管你中间费了多少劲，没有结果可不行啊。。。求小伙伴儿分析原因，相助
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zhaijc@foxmail.com
1楼 2016-09-19 10:37:19
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回帖置顶 ( 共有1个 )

lyzjc

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:44:32
xn8008: 应助指数+1 2016-10-14 09:44:49
lyzjc: 回帖置顶 2017-03-03 19:46:10
谢谢各位回复。
经自己的不断重复摸索，成功连接了一个，并且成功测序。今天做的菌液PCR鉴定也成功扩增出阳性克隆，已送去测序。

1、克隆相关的试剂一个都没有更换。
2、怀疑连接时间不够，把连接时间增加到6h左右。
3、怀疑与菌液浓度有关，把摇菌所加液体LB培养基增加到4ml和2ml，且都有扩增成功。

我认为一般克隆不成功的原因，再排除操作手法的原因之后，最大可能得原因有两点：
1、连接不成功
2、菌液PCR环节出了问题，最有可能就是菌液浓度。

希望给自己，也给大家一个经验参考。
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zhaijc@foxmail.com
15楼2016-10-13 19:46:39
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-09-19 21:28:30
xn8008: 应助指数+1 2016-10-14 09:42:15
(16℃连接3h，使用的是PCR仪器。)我一直都是放保温杯里，16℃过夜的，十次有8.9次成功。
别用蓝白板筛选，别加IPTG，直接加AMP筛选。选他8个，8个没有就不用在筛了。
最主要的还是pMD 18-T ，国产的往往今天能连上，一个星期后就连不上了，这个我还是用TAKARA的，小日本试剂的稳定性还是可以的。
PCR时不要用高保真酶。
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采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2016-09-19 15:28:09
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lyzjc

银虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:43:30
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小冀- at 2016-09-28 23:54:20
菌长出来了，应该不是转化的问题，考虑是不是载体问题，会不会自连了，我们用19t，有时候假阳性特别多，p不出来，后来酶切发现全都自连的，后来换个批次就好了

“换个批次”的意思是重新买同样的么？还是换一种载体？
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zhaijc@foxmail.com
10楼2016-10-01 08:13:36
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普通回帖

lyzjc

银虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:42:10
引用回帖:
2楼: Originally posted by 781055707 at 2016-09-19 15:28:09
(16℃连接3h，使用的是PCR仪器。)我一直都是放保温杯里，16℃过夜的，十次有8.9次成功。
别用蓝白板筛选，别加IPTG，直接加AMP筛选。选他8个，8个没有就不用在筛了。
最主要的还是pMD 18-T ，国产的往往今天能连上 ...

谢谢回复。

保温杯？。 成功率挺高的啊，我一直用PCR仪器，也用过恒温水浴锅，都是16℃连接3h。以前这么做出过，不知道是不是这方面的原因

跟是否用蓝白斑筛选也不知道有没有什么关系。。pMD 18 T vector我用的也是takara的

PCR使用的酶是普通的Taq酶，也是小日本的
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zhaijc@foxmail.com
3楼2016-09-19 17:46:48
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lyzjc

银虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:42:33
自己顶一下吧

又做了一次，加了对照组，对照组菌落铺满了平板，而实验组零星的菌落，摇菌中，祝我成功。
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zhaijc@foxmail.com
4楼2016-09-21 15:44:27
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王进喜哥

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:42:40
你用的是什么引物呢
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5楼2016-09-28 17:01:36
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werq63

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:42:49
xn8008: 应助指数+1 2016-10-14 09:42:56
对照长满了是用的抗性平板吗，如果是用的抗性平板，对照应该不长的，或者长得很少的
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6楼2016-09-28 18:56:26
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:43:01
xn8008: 应助指数+1 2016-10-14 09:43:15
菌长出来了，应该不是转化的问题，考虑是不是载体问题，会不会自连了，我们用19t，有时候假阳性特别多，p不出来，后来酶切发现全都自连的，后来换个批次就好了

发自小木虫Android客户端
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···
7楼2016-09-28 23:54:20
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lyzjc

银虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:43:12
引用回帖:
5楼: Originally posted by 王进喜哥 at 2016-09-28 17:01:36
你用的是什么引物呢

用的是之前PCR扩增引物
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zhaijc@foxmail.com
8楼2016-10-01 08:08:29
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lyzjc

银虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:43:22
引用回帖:
6楼: Originally posted by werq63 at 2016-09-28 18:56:26
对照长满了是用的抗性平板吗，如果是用的抗性平板，对照应该不长的，或者长得很少的

对照组用的是购买pMD 18-T载体里面的control，应该是500bp的序列片段，理论上应该是500bp片段插入到载体中，用抗性平板，应该也会长，或者长势挺好才对吧
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zhaijc@foxmail.com
9楼2016-10-01 08:11:31
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