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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆，连接转化能长菌落，但是菌液PCR鉴定没有结果
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小冀-

版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:43:49
xn8008: 应助指数+1 2016-10-14 09:43:59
引用回帖:
10楼: Originally posted by lyzjc at 2016-10-01 08:13:36
“换个批次”的意思是重新买同样的么？还是换一种载体？...

重新买，你想换一种载体的话也可以

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···
11楼2016-10-01 08:39:06
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ttszero

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:43:55
xn8008: 应助指数+1 2016-10-14 09:44:04
产物多大？如果太大或者本身多ta重复，建议用同源重组方法连接

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12楼2016-10-02 18:19:12
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cuihao102

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:44:10
建议做下质粒DNA提取，如果加入的片段足够长，电泳时阳性克隆和对照质粒区别会很明显，再做下酶切，一目了然。虽然是笨办法，但是很奏效。
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13楼2016-10-02 19:16:02
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wywahh

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:44:20
菌液pcr也可能出现扩不出来的情况，可以送一批去测序，做转化的时候做对照了吗，确定感受态没有问题吗？这些都没有问题，还可以摇菌提取质粒来重新扩增检测。
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14楼2016-10-13 08:18:06
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lyzjc

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:44:32
xn8008: 应助指数+1 2016-10-14 09:44:49
lyzjc: 回帖置顶 2017-03-03 19:46:10
谢谢各位回复。
经自己的不断重复摸索，成功连接了一个，并且成功测序。今天做的菌液PCR鉴定也成功扩增出阳性克隆，已送去测序。

1、克隆相关的试剂一个都没有更换。
2、怀疑连接时间不够，把连接时间增加到6h左右。
3、怀疑与菌液浓度有关，把摇菌所加液体LB培养基增加到4ml和2ml，且都有扩增成功。

我认为一般克隆不成功的原因，再排除操作手法的原因之后，最大可能得原因有两点：
1、连接不成功
2、菌液PCR环节出了问题，最有可能就是菌液浓度。

希望给自己，也给大家一个经验参考。
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zhaijc@foxmail.com
15楼2016-10-13 19:46:39
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lemonvivi

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:44:40
xn8008: 应助指数+1 2016-10-14 09:44:53
染菌了
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16楼2016-10-14 09:06:08
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彭江容

新虫 (小有名气)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-08 09:22:29
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小冀- at 2016-09-28 23:54:20
菌长出来了，应该不是转化的问题，考虑是不是载体问题，会不会自连了，我们用19t，有时候假阳性特别多，p不出来，后来酶切发现全都自连的，后来换个批次就好了

换个批次是什么意思？

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17楼2016-11-07 20:44:47
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彭江容

新虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-11-08 09:22:33
引用回帖:
11楼: Originally posted by 小冀- at 2016-10-01 08:39:06
重新买，你想换一种载体的话也可以
...

我想问一下啊，我做的菌长出来了，做了菌液pcr，然后电泳检测，发现有特异性条带，但是测序后做序列比对差了很多，这是什么原因呢？谢谢！

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18楼2016-11-07 20:50:02
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彭江容

新虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-11-08 09:22:38
引用回帖:
14楼: Originally posted by wywahh at 2016-10-13 08:18:06
菌液pcr也可能出现扩不出来的情况，可以送一批去测序，做转化的时候做对照了吗，确定感受态没有问题吗？这些都没有问题，还可以摇菌提取质粒来重新扩增检测。

转化时的对照应该怎么做啊？

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19楼2016-11-07 20:51:34
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小冀-

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【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-11-08 09:24:06
引用回帖:
18楼: Originally posted by 彭江容 at 2016-11-07 20:50:02
我想问一下啊，我做的菌长出来了，做了菌液pcr，然后电泳检测，发现有特异性条带，但是测序后做序列比对差了很多，这是什么原因呢？谢谢！
...

是加A连接之后测序不对吗？考虑正反的问题，反过来比对看看

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···
20楼2016-11-07 20:51:57
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