| 查看: 4811 | 回复: 40 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
TA克隆，连接转化能长菌落，但是菌液PCR鉴定没有结果 已有4人参与
|
|||
|
PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒回收纯化PCR产物，电泳检测条带单一，浓度为50ng/微升。 PCR产物和pMD 18-T 载体连接，连接体系是：PCR产物3.5微升，pMD 18-T vector 1微升，水0.5微升，Solution I 5微升。16℃连接3h，使用的是PCR仪器。 固体LB培养基配制：胰蛋白胨1g，酵母浸粉0.5g，氯化钠1g，加水定容100ml，调节PH为7.5，高温高压灭菌30min，待温度适宜，加入IPTG 20微升，X-gal 100微升，AMP 100微升，倒板。 10微升连接产物全部转入50微升大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min，加入700微升液体LB培养液，37℃恒温摇床200rpm 1h，4000rpm离心5min，弃上清500微升，重悬浮，涂板，37℃过夜培养。我看有些人的实验记录都是12-14h就能挑菌了，但是我的12-15h内很难看清蓝白斑，我一般是等到16-18h之间才能很明显分辨出蓝白斑菌落，这时候才能挑白斑，于1ml 含1微升AMP的液体LB培养液中，37℃恒温摇床复苏8h。 菌液PCR鉴定，10微升体系是：Taq酶0.05微升，buffer 1微升，dNTP 0.8微升，上游引物0.5微升，下游引物0.5微升，菌液1微升0.5微升0.3微升都有做过，加水至10微升。引物使用的是之前PCR扩增引物。反应程序有所改变，95℃预变性时间从之前的5min变成15min。 挑单克隆菌落的时候，看着蓝白斑菌落很明显能分开，并且感觉长势不错，信心满满，但是菌液PCR怎么都没有条带，心都碎了。。。。crying 在半个月之前用同样的方法，不同的基因克隆，还做的不错，测序结果也挺好。 1、有人说插入片段和载体的比例，我算了一下，符合比例的范围啊。 2、不是不长菌落，能区分蓝白斑，只是时间久点，感觉长的还不错。 3、菌液PCR做了梯度，还做了对照，酶等试剂没有问题。 可是还找不到原因原因到底在哪啊。。。。老板不管你中间费了多少劲，没有结果可不行啊。。。求小伙伴儿分析原因，相助  |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有196人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- TA克隆测序菌落PCR，时隔半年，换了载体试剂盒，还是150bp
已经有16人回复
- SSH后建立cDNA文库，挑的菌落太少？
已经有2人回复
- 亲们，关于TA克隆什么的，不是很理解
已经有6人回复
- 酶切，连接，转化，已快崩溃
已经有41人回复
- 求助：图片为菌液PCR后的结果，送测序的话可以得到满意的结果吗
已经有11人回复
- 克隆，转化，全长cDNA克隆，表达目的蛋白。PMD18-
已经有5人回复
- 【专题】基因克隆知识问答及FAQ
已经有0人回复
小冀-
版主 (著名写手)
- 应助: 713 (博后)
- 贵宾: 3.033
- 金币: 11446.9
- 散金: 1055
- 红花: 82
- 帖子: 2509
- 在线: 445.9小时
- 虫号: 1521695
- 注册: 2011-12-03
- 性别: GG
- 专业: 生物信息学
- 管辖: 微生物
【答案】应助回帖
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:43:01
xn8008: 应助指数+1 2016-10-14 09:43:15
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-10-14 09:43:01
xn8008: 应助指数+1 2016-10-14 09:43:15
|
菌长出来了，应该不是转化的问题，考虑是不是载体问题，会不会自连了，我们用19t，有时候假阳性特别多，p不出来，后来酶切发现全都自连的，后来换个批次就好了 发自小木虫Android客户端 |
7楼2016-09-28 23:54:20
2楼2016-09-19 15:28:09
3楼2016-09-19 17:46:48
4楼2016-09-21 15:44:27
