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[求助]
SSH后建立cDNA文库，挑的菌落太少？
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做完抑制消减杂交后，想将第二轮PCR产物进行TA克隆，建立cDNA文库，测序看一下有哪些差异基因。第一次做TA克隆有很多问题，寻求各位虫友的解答。 先把实验过程描述一下：首先是SSH，第二轮PCR产物检测；按照 TAKARA 公司的 DNA Fragment Purification Kit 进行 PCR 产物纯化；TAKARA的pMD19-T载体试剂盒，连接时同时做了样品和阳性对照（试剂盒自带的insert control）,连接前先将试剂盒中的各种试剂及样品从－20度冰箱取出于冰上解冻。（方法与“TA克隆菌落PCR菜鸟求助”这个帖子上的差不多） 样品的连接体系是：5μL Solution I + 4μL 目的PCR产物+ 1μL pMD19-T vector 阳性的连接体系是：5μL Solution I + 1μL insert control + 3μL ddH2O + 1μL pMD19-T vector 阴性对照：5μL Solution I+5μL ddH2O 连接条件是：16度0.5h，1h，过夜（8h）（这三个时间都试过），我是在PCR仪上做的连接；转化： 1、转化用的是北京全式金的Trans1-T1感受态细胞（送来后当天就使用），先于冰上解冻，全量（10μL）连接体系加入100μL感受态细胞，做转化。2、将以上各样品用枪轻轻吹打混匀，并置于冰上30min. 3、将管放入预加热至42℃的水浴中，恰恰放置90s，切忌摇动EP管。4、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3min。5、每管加890μL 37℃LB培养基（没有预热，常温25度左右，有没有关系？），然后将管转移到37℃的摇床上250rpm培养1h。6、培养结束后，将各管室温4000rpm离心2min，用枪吸弃部分上清，使剩余体积约为200μL，并将菌体沉淀与剩余的培养基吹打均匀，然后涂布达到室温的LB琼脂平板(Amp/IPTG/X-Gal)培养后发现阳性对照和样品都有菌落，阴性没有。 我的问题是：1我的阳性对照有250个左右菌落（不知道大家的？），我咨询Takara，条件优化下，大概可以长2-10万菌株；我的实验组也就60个左右菌株，我看文献，有200-5000个。我能不能说我实验结果是转化效率不足导致的？转化效率不高的原因有哪些？2 我用的感受态细胞，有白色的沉淀，离心沉淀很明显，我没有用过别的感受态，细胞培养什么也没接触过，但是这么明显的沉淀是对的吗？不是自己制备的时候要测OD，有沉淀就不均匀了怎么测，我涂板可以直接吸沉淀？3我看过一个视频，转化过程用的是玻璃试管，普通塑料的1.5mL离心管有没有问题？3挑到的单克隆菌体，到底加多少量的含Amp的LB培养液（200μL-5mL都见过，要测序），时间几许？ |
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没人回复 实验做完了，自己总结一下：1 实验所用的药品，感受态什么都是好的，没有问题 2 阴性对照和阳性对照很关键，我最后找到问题就是靠对照排除的 3最初挑的菌落是白色的，但是菌液PCR什么都没有,说明白色菌落不一定都是正确的，菌液PCR快速鉴定还是靠谱的 4实验失败的原因是，PCR产物反复冻融（大概有5次），我纯化后没有跑胶检测一下，转化后有白色菌落，但是全是假阳性 5重新来过，PCR扩增后，立即纯化PCR产物，跑胶和测OD，都OK，做了两次转化（试了下不同浓度的PCR产物），都成功了，期间放在4度三天（说明放三天还可以保证实验成功）。PCR产物不能加太多了，要不然长的满满的，而且都长不大，我是按2倍，4倍稀释的，效果不错！over |
2楼2014-10-29 18:39:20
3楼2016-01-20 18:01:10
